东南沿海某省LQ地区从事拆解废旧电器业已有近20年的历史,废旧电器拆解和回收利用过程中,包括铅、汞、镉、铬等重金属以及多种持久性有机污染物如多氯联苯、多溴联苯、多溴联苯醚等通过多种途径进入环境,引起环境污染。而且,污染物进入生物体后在组织中富集,对生物体产生毒性效应。在已有研究^{〔1, 2〕}基础上,本研究以该地区作为污染区,以无电子拆解业的LY地区作为对照区。对2地区鲫鱼肝脏酶学指标变化及河水浓集物的遗传毒性、雌激素活性等毒理学指标进行检测。现将结果报告如下。

二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,美国 sigma-aldrich公司);还原型辅酶Ⅱ(上海伯奥生物科技公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供);重组人雌激素受体(human-estradiol receptor,h-ER)基因酵母菌检测环境样本中类雌激素总体效应浓度试剂盒(酵母干粉型)(中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室提供);Resorufin ethyl ether,标准Resorufin,BCA Protein Assay Kit (美国Sigma-Aldrich公司)。

F-7000荧光分光光度计(日本日立高技术公司);722型可见光分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司);FSH-2型可调高速匀浆机(江苏省金坛市富华仪器有限公司);Eppendorf centrifuge 5810R冷冻离心机(德国Eppendorf股份公司);Eppendorf centrifuge 5810高速离心机(德国 Eppendorf股份公司);AL204-IC电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

样品于2008年5-7月采集。以城区为中心,等距离梅花状布点,每一地区设5个采样点。要求采集前3 d未下雨,每个采样点采集地表水(河中心水面＜ 20 cm)10 L,将每一地区5个采样点的水样混合,50 L混合水样作为一个样本进行浓缩处理。经XAD-II树脂吸附、乙醚洗脱、挥干,DMSO定容为50 L/mL (即1 mL DMSO中含有50 L原水样有机浓集物),用于鼠伤寒沙门菌突变试验 (Ames试验)和重组基因酵母试验。捕捉调查地区辖区内10只活的野生鲫鱼进行解剖,取出肝脏,液氮速冻,-70℃保存。试验前,将肝脏样本取出,室温融化,称取约1.5 g肝脏,按0.1 g/mL加入生理盐水制备10%的组织匀浆,4℃ 3 000 r/min离心15 min,取上清,冰上存放,用于SOD、GSH-Px、细胞色素P4501A1活性及MDA含量的测定。

按试剂盒说明书进行。

将鲫鱼肝脏前处理后的上清样本20 μL加入微孔板之中,同时加入底物20 μL,0.002 5 mol/L还原型辅酶Ⅱ40 μL,pH7.8三羟基氨甲烷盐酸盐 (Tris-HCL)缓冲液120 μL,每个样本做3个平行孔,于25℃避光保温30 mim,再加入1 mol/L NaOH终止液50 μL终止反应,用荧光分光光度计以激发波长530 nm,发射波长590 nm测定荧光A值。以A值在细胞色素P4501A1测定标准曲线图上得到相应P4501A1酶浓度值。根据公式P4501A1酶活性(μmol/g·min)=P4501A1酶浓度(μmol/L)÷蛋白含量 (g/L)÷时间(min)计算细胞色素P4501A1活性。蛋白含量通过2,2 '-二辛可宁酸(bicinchoninic acid BCA)法进行测定。

按文献〔3〕方法。

按试剂盒说明书进行。重组人雌激素受体基因酵母的构建按文献〔4〕。将水样浓集物稀释为终体积8 mL,相当于原水量8、20、50、125、312、781、1953 mL 7个浓度(2.5倍组距)进行实验。

采用SPSS11.5统计软件进行方差分析。

表 1

表 1 不同地区鲫鱼肝脏SOD、GSH-Px、P4501A1 活性和 MDA 含量(x± s，n = 10)

表 1 不同地区鲫鱼肝脏SOD、GSH-Px、P4501A1 活性和 MDA 含量(x± s，n = 10)

污染区SOD活性明显低于对照区,差异有统计学意义,说明污染区鲫鱼肝脏受到环境污染物影响,抗氧化能力有所降低。污染区鲫鱼肝组织P4501A1活性高于对照区> 2.5倍。污染区鲫鱼肝脏MDA含量也明显高于对照区。

表 2

表 2 不同地区水样浓集物Ames 试验结果

表 2 不同地区水样浓集物Ames 试验结果

污染区水样浓集物在1.00 L/皿浓度加S9条件下,TA98均数比(mean ratio,MR)值为2.03,且在浓度为0.25,0.50,1.00 L/皿加S9条件下TA98回变菌落数呈剂量反应关系(MR值分别为1.08,1.32,2.03),Ames试验结果污染区水样浓集物具有诱变性。对照区水样浓集物在 0.50 L/皿浓度不加S9条件下,TA98MR值为2.21;在1.00 L/皿浓度不加S9条件下,TA98MR值(1.75)有所下降,这可能是因为对照区高剂量水样浓集物对TA98菌株有一定的毒性效应,说明对照区水样浓集物也呈现一定程度的诱变性。

表 3

表 3 不同地区水样浓集物半乳糖苷酶活性(U 值，x ± s)

表 3 不同地区水样浓集物半乳糖苷酶活性(U 值，x ± s)

在雌二醇(阳性对照)浓度为1 × 10^-11、1 × 10^-10、1 × 10^-9 mol/L时半乳糖苷酶活性U值分别为(0.010 8 ± 0.007 0)、(0.083 4 ± 0.013 7)、(0.185 6 ± 0.020 1)。2地区水样浓集物半乳糖苷酶活性均＜ 0.019 0,也未见明显剂量反应关系,2地区水样浓集物均未显示出明显的雌激素活性。同时,多个半乳糖苷酶活性为负值,这可能与水样浓集物对酵母菌有一定的毒性效应有关。

环境污染物可引起机体氧化应激,因此与机体抗氧化防御系统相关的酶和参数可被作为有机污染物存在和影响的生物标志^〔5〕。近年来,以P450酶系作为毒物毒性的接触生物标志物已广泛应用于毒理学研究中。鱼肝细胞色素P4501A1作为有机污染物的生物标志物,已经应用于现场研究^〔6〕。本研究也证明P4501A1是一种评价环境污染状况比较灵敏的生物标志物。

Ames试验是应用于地表水诱变性与遗传毒性研究最为广泛的试验^〔7〕。对照区水样浓集物也呈现一定程度的诱变性,这可能是由于当地其他环境污染物污染水环境造成的。本研究结果显示,污染区水样浓集物是在经过S9转化后具有诱变性,属于间接致突变物,而对照区水样浓集物在未加S9时具有诱变性,属于直接致突变物,说明两地区水样致突变的污染物类型不同。在本实验条件下,2个地区水样浓集物均未显示出明显的雌激素活性,可以采用更有效的环境雌激素效应检测方法对污染区的水样进行检测。

环境的污染最终将导致人类健康受到影响。近期对两地区儿童血液多种持久性有机污染物含量研究显示,污染区儿童血样多氯联苯,二恶英浓度明显高于WHO的规定且污染区儿童血样多氯联苯,多溴联苯醚,有机氯含量明显高于对照区^〔8〕,这些结果均说明对环境污染的监管和治理刻不容缓。