中国公共卫生  2011, Vol. Issue (10): 1250-1252   PDF    
引用本文
徐菊玲, 徐伯赢, 周洪昌, 张慧, 段劲, 薛利军, 邵圣文. 结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立[J]. 中国公共卫生, 2011, (10): 1250-1252.
XU Ju-ling, XU Bai-ying, ZHOU Hong-chang, et al. Establishment of fluorescence quantitative PCR assay in detection of Mycobacterium tuberculosis[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, (10): 1250-1252.
结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立
徐菊玲1, 徐伯赢1, 周洪昌1, 张慧1, 段劲1, 薛利军2, 邵圣文1     
1. 湖州师范学院医学院创新实验室, 浙江湖州313000;
2. 南京军区南京总医院肿瘤内科
收稿日期: 2011-06-13.
基金项目: 国家自然科学基金(30800988)
作者简介: 徐菊玲(1975- ),女,浙江湖州人,讲师,硕士,研究方向:感染性疾病防治。
通讯作者: 邵圣文,E-mail:sswdream@163.com
摘要: 目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价。方法 针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculo-sis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR(FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV)。结果 靶向Mtb 16SrDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA)1.2 pg/μL,即(38.9±3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27%和1.26%。结论 以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测。
关键词: 结核杆菌     16S rDNA     荧光定量PCR    
Establishment of fluorescence quantitative PCR assay in detection of Mycobacterium tuberculosis
XU Ju-ling, XU Bai-ying, ZHOU Hong-chang, et al    
Laboratory of Innovation, Medical School of Huzhou Teachers College, Huzhou 313000, China
Abstract: Objective To establish and assess a rapid real-time quantifiable method for the detection of Mycobacterium tuberculosis(Mtb).Methods The specific primers targetting 16S rDNA gene in Mtb were designed and the fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)assay was performed with SYBR Green I.After extraction of Mtb genomic DNA,the 16S rDNA fragment was amplified by conventional PCR and used to construct recombinant pMD-TB16S plasmid.Then,the serial dilutions of pMD-TB16S plasmid were subjected to the quantitation standard curve in FQ-PCR assay.The sputum samples from 11 patients with pulmonary tuberculosis were detected by the same FQ-PCR,with various genomic DNAs of Streptococcus viridans,Staphylococcus epidermidis,Staphylococcus aureus,and Escherichia coli used as the negative control to confirm specificity of FQ-PCR assay.The stabiity was analyzed with inter and intra FQ-PCR test by using the same Mtb genomic DNA,and the coefficient of variation(CV)values of threshold cycle(Ct)were calculated.Results The primers targetting Mtb 16S rDNA gene were specific to the amplification of 16S rDNA gene of Mtb but not other bacteria in control group by FQ-PCR,with the sensitivity of 1.2 pg/μL of Mtb genomic DNA or 38.9±3.54 copies/μL of 16S rDNA,and the CV values of Ct were 1.26% and 0.27% for inter and intra FQ-PCR assay.Conclusion The FQ-PCR assay targetting Mtb 16S rDNA gene is of rapid,sensitive,specific,and quantifiable in Mth detection.
Key words: Mycobacterium tuberculosis     16S rDNA     fluorescence quantitative PCR    

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)又名结核杆菌,由其引起的结核病为世界三大传染病之一〔1〕。近年来,耐药性结核菌株扩散,结核病新发病例增多,给结核病防治带来严峻挑战〔2, 3〕。传统结核杆菌培养法需要4~8周才能明确诊断,痰涂片抗酸染色法漏检率较高。为克服传统方法学固有缺陷,需要发展敏感性高、特异性强的结核杆菌快速检测技术〔4〕。微生物16S rDNA基因属于看家基因,具有种属高保守性。近年来,以16S rDNA为靶基因的荧光定量PCR (fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术在病毒、支原体等微生物快速检测方面发展迅速〔5, 6〕。应用该技术快速检测结核杆菌是当前研究热点。本研究以16S rDNA为靶基因,建立结核杆菌FQ-PCR快速定量检测方法,结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

Mtb标准株H37Rv (浙江中医药大学朱明利教授惠赠),改良罗氏斜面培养基(杭州创新生物检控公司)。质粒小量提取试剂盒、细菌基因组DNA提取、DNA 凝胶回收试剂盒(杭州爱思进公司)。Taq DNA聚合酶、4 × dNTP (0.2 mmol/L)、基因克隆载体pMD19T与SYBR Green I 荧光染料预混试剂SYBR-Taq (大连宝生物公司)。LineGeneK FQD-48A型荧光定量PCR仪(杭州博日公司)。

1.2 方法 1.2.1 结核杆菌16S rDNA引物设计与合成

根据Mtb标准株H37Rv (GenBank:AL123456)16S rRNA基因序列(NC_ 000962)设计引物,正向引物Pf序列为5'AAGGCGACGACGGGTAGC,反向引物Pr序列为5'GAAGGCCGTCATCCCCCA,基因比对证实无同源性,扩增片段长150 bp,靶向Mtb 16S rRNA基因的232-381碱基区域。引物合成由上海英骏公司完成。

1.2.2 Mtb基因组DNA模板制备

采用罗氏斜面培养基培养Mtb菌(37℃,2周),取Mtb菌107CFU/mL,高压灭菌后采用试剂盒提取、纯化细菌基因组DNA,分光光度计测定浓度与纯度,-20℃保存备用。

1.2.3 16 S rDNA重组质粒构建

PCR法扩增Mtb 16 S rDNA基因片段,反应体系组成:10 × Taq缓冲液2.5μL,4 × dNTP 1μL,Pf及Pr引物(20 μmol/L)各0.3 μL,Taq 酶(2.5 u/μL)0.5 μL,Mtb基因组DNA (1μg)1 μL,加去离子水至25 μL。反应条件:95℃变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火35 s,72℃延伸50 s,循环30次;72 ℃延伸5 min。回收16 S rDNA片段,连入pMD19T载体,得到重组质粒pMD-TB16 S,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选并测序,提取重组质粒备用。

1.2.4 FQ-PCR检测Mtb体系组成

SYBR-Taq试剂12.5 μL,Pf及Pr引物(5 μmol/L)各1 μL,Mtb基因组DNA 2 μL,水8.5 μL。反应条件:94℃预变性30 s;94℃变性5 s,60℃ 退火20 s,72℃延伸10 s并采集荧光信号,循环40次。熔链曲线分析:65℃~94℃,起始温度40 s,恒温5 s,采集荧光信号,分析得到熔链曲线及解链温度(Tm)值。定量标准曲线建立:将pMD-TB16S标准质粒稀释为5个浓度,即(1.9 × 106~ 1.9 × 102)拷贝/μL,检测各浓度反应管循环阈值(threshold cycle,Ct),应用曲线拟合法得到标准曲线方程式为:y=- 3.22 lg (x)+32.46(r=-0.999 9)。

1.2.5 FQ-PCR检测Mtb方法评价

敏感性分析:以系列稀释Mtb基因组DNA (1.2 × 103 pg/μL~1.2 × 10-1 pg/μL)为模板,反应体系及反应条件同1.2.4,确定检测方法灵敏度。 特异性分析:以甲型链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌基因组DNA (1.2 × 102 pg/μL)为对照,检验FQ-PCR 方法特异性。稳定性分析:选用同一份Mtb基因组为模板进行批内和批间试验,实验重复3次,计算变异系数,检验方法稳定性。

1.2.6 临床标本检测

取11份肺结核患者痰标本,高压蒸气灭菌后采用试剂盒提取并纯化Mtb基因组DNA,再进行 FQ-PCR检测。

2 结 果 2.1 Mtb 16S rDNA标准质粒制备(图 1)
注:1:16S rDNA基因产物;M:分子量标准。 图 1 Mtb 16S rDNA 基因PCR 扩增产物

Mtb 16S rDNA基因PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测,回收PCR产物片段,连接pMD19-T载体并转化,测序证实成功构建了重组标准质粒pMD-TB16S。

2.2 敏感性分析(表 1)
表 1 FQ-PCR 检测Mtb 的敏感性(x±s)

结果显示,FQ-PCR法检测Mtb的灵敏度为1.2 pg/μL的Mtb基因组DNA,即(38.9 ± 3.54)拷贝/μL的16s rDNA基因(以Ct < 30为阳性)。

2.3 特异性分析(图 2)
图 2 FQ-PCR 检测Mtb 的特异性

图 2显示各检测管产物均为单一峰,即为单一产物,Tm值为89℃。分别以1.2 × 102 pg/μL 的甲型链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的基因组DNA为模板,以双蒸水作为无模板对照,采用本文 FQ-PCR法进行检测,Ct值均> 30,即检测结果为阴性。

2.4 稳定性分析

采用本文FQ-PCR法检测Mtb,批间及批内实验Ct值分别为(22.31 ± 0.28)和(22.35 ± 0.06),变异系数分别为1.26%和0.27%,方法稳定性良好。

2.5 痰标本Mtb检测结果

采用FQ-PCR法检测11份痰标本,结果显示标本中Mtb含量介于(2.24 × 101~2.69 × 107) 拷贝/μL。产物熔链曲线显示,各标本检测产物均为单一的特异性产物峰。

3 讨 论

结核病为全球性公共卫生问题〔7〕。近年来,结核病新发病例增多,耐药菌株扩散严重,引起高度重视〔2, 3〕。对结核杆菌进行快速定量检测,既有利于尽早治疗,还能动态监测药物疗效,指导临床用药,减少耐药菌株出现。传统普通PCR方法适用于定性或半定量检测〔8〕。近年出现的FQ-PCR技术,将实时荧光监测与普通PCR技术相结合,能够对目标微生物进行实时定量检测,已被成功用于微生物快速定量检测〔9, 10〕。FQ-PCR技术特异性取决于检测靶基因及扩增引物。16S rDNA基因具有较高种属保守性,作为检测靶基因具有高度特异性〔5, 6〕。本研究以结核杆菌16S rDNA为靶基因,采用保守区引物进行检测,结果证实该引物仅扩增结核杆菌,并得到单一产物,特异性高。

本研究采用FQ-PCR法检测Mtb,最低检出限为1.2 pg/μL,即(38.9 ± 3.54)拷贝/μL。由于Mtb全基因组(Gen- Bank:AL123456)含有1个拷贝的16S rDNA基因,因此本文方法的检测灵敏度为35~41条Mtb。痰涂片抗酸染色法检出限为5 000~10 000条Mtb,普通PCR法为1~20条 Mtb〔11〕。本文FQ-PCR方法敏感性高于抗酸染色法1 000倍左右,但稍低于普通PCR法,可能跟样品前处理时Mtb基因组DNA提取效率有关。改进样品中Mtb基因组DNA提取率,进而提高方法敏感性尚有待进一步研究。采用FQ-PCR 法检测临床标本Mtb耗时约3 h (包括样品高压蒸汽灭菌、基因组DNA提取以及FQ-PCR反应),特异性强、灵敏度高,具有快速和定量检测双重优点。

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