弓形虫病是一种全球分布的人兽共患食源性寄生虫病,其主要传播途径为生食或半生食含有弓形虫包囊的肉品。在肉用畜禽中,猪、牛、羊、鸡均有感染,以猪的感染率最高^〔1〕。 由于肉品弓形虫检验缺乏国家标准或行业标准^〔2〕,沿用的动物接种法操作繁琐,时间周期长达2~3周,检测效率不高。 为提高检测效率,以小鼠弓形虫慢性感染动物模型,对肌肉 PCR样品处理方法进行改进,建立具有较高检出率和特异性、 用时短、操作简便、适于肌肉弓形虫包囊PCR检测方法。

Gel Doc-XR凝胶图象处理系统(美国Bio-Rad公司);光学显微镜(厦门Motic公司); PTC0220G基因扩增仪(美国Bio-Rad公司);HR2860小型食品粉碎仪(珠海Philips公司);淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司);Chelex-100(美国Sigma公司);Red- Taq酶(上海赛百盛基因技术有限公司)。

从交通大学医学院引进弓形虫弱毒株 Prugniaud株,该株常以包囊的形式存在于小鼠脑组织^〔3〕。通过喂饲方式转种于昆明系雄性,15~17 g小鼠(上海实验动物中心),3 个月后将小鼠断颈处死,取脑组织和双侧腿部肌肉组织,采用直接压片法,在显微镜下(100 ×)检查弓形虫包囊。采用淋巴细胞分离液法^〔4〕纯化部分脑组织包囊,分别在 3份正常小鼠肌肉组织内每g掺入1、5和10只包囊,观察 PCR方法的灵敏度。PCR对照材料系常规饲养3个月的昆明系小鼠脑组织和双侧腿部肌肉组织,以及隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫包囊(澳大利亚BTF公司),均按同法进行PCR样品处理。

分别取0.5 g脑组织和1 g肌肉组织,洗净,粉碎,匀浆过滤,16 500 × g离心5 min,弃上清液,取0.05 g沉淀物(肌肉匀浆取0.1 g)加于1.5 mL离心管内,加生理盐水 1 mL,以16 500 × g离心10 min;弃上清液,加DNA提取液1 mL,混匀器充分混匀,置水浴锅内煮沸10 min;置4℃冷却20 min,以16 500 × g离心5 min,上清液即为DNA模板。

根据化学试剂成分和浓度不同,配制7种DNA提取液(A~G),基础成分为NaOH、 NaCl/KCl,区别在于表面活性剂及其浓度差异,A提取液为 SDS,B为EDTA和TritonX-100,C为EDTA和SDS,D为NP -40和Tween-20,E为2倍的NP-40和Tween-20,F提取液是在E基础上再加入Chelex-100,G用KCl取代NaCl,其它同F。并以市售DNA提取液(北京索奥生物医药科技有限公司)为对照,同时处理1份含弓形虫包囊肌肉组织匀浆(处理方法同上),制备成DNA模板后进行PCR扩增,比较样品处理效果,以选择最适DNA提取液。

目的基因选择对弓形虫具有种特异性的B1 基因,根据Burg等^〔5〕方法选择1对引物,由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序列为5'-GGAACTGCATCCGTTCATGAG -3',下游引物序列为5'-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC -3',扩增产物为194 bp核苷酸片段。PCR反应体系为 20 μL,其中模板2 μL,上下游引物各2 pmol,RedTaq酶1 u,25 mmol MgCl₂ 1.2 μL,10 mmol dNTPs 0.5 μL。反应条件:94 ℃预变性3 min,94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,35个循环,最后,72℃ 7 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离(上样量10 μL,电压5 V/cm)30 min,凝胶图象处理系统摄片观察结果,194 bp有扩增条带为阳性。

32只感染弓形虫包囊的小鼠,经直接压片镜检,全部小鼠的脑组织均检出弓形虫包囊,11只小鼠的腿部肌肉组织检出弓形虫包囊,阳性率分别为100% 和34.4%。

图 1

注:M:DNA标志物(100 bp);1-7:A-G DNA提取液;8:对照组。 图 1 7 种DNA 提取液的PCR 效果

7种DNA提取液同时对 1份含弓形虫包囊的肌肉组织匀浆进行处理,结果显示,有3 种提取液效果优于对照的市售产品,以G提取液为最适DNA 提取液。其提取的弓形虫DNA模板经PCR扩增的条带非常明亮,背景也比较清晰。

图 2

注:M:DNA标志物(100 bp);1:小鼠脑弓形虫包囊;2:小鼠肌肉 弓形虫包囊;3:正常小鼠脑组织;4:正常小鼠肌肉组织;5:隐孢子虫卵 囊;6:贾第鞭毛虫包囊。 图 2 弓形虫包囊PCR 特异性检测结果

图 3

注:M:DNA标志物(100 bp);1:阴性对照;2-4依次为1、5、10 只包囊/g肌肉。 图 3 弓形虫包囊PCR 灵敏度检测结果

用新建立的PCR方法检测32 份脑组织均检出弓形虫DNA,阳性检出率达100%,与直接压片法的结果一致。32份肌肉组织中,弓形虫DNA阳性为20 份,阳性检出率达62.5%,明显高于直接压片法。对10份正常对照小鼠的脑组织和肌肉组织的检测结果均为阴性,隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫包囊的DNA模板均未扩增出任何条带,显示出较高特异性。在正常小鼠肌肉组织内每克掺入1、 5和10只包囊,PCR检测结果均为阳性,具有较高灵敏度。

迄今肉品弓形虫PCR技术研究的文献报道较少,存在的主要问题是目的基因选择偏窄、样品处理过程烦琐费时,达不到快速简便的要求,限制了对大批量样品的检测需求^{〔6, 7〕}。 图 2弓形虫包囊PCR特异性检测结果注:M:DNA标志物(100 bp);1:阴性对照;2-4依次为1、5、10 只包囊/g肌肉。 图 3弓形虫包囊PCR灵敏度检测结果采用食品粉碎仪直接将肌肉粉碎,利于快速释放包囊内的弓形虫缓殖子。再经改进的DNA提取液(以Chelex-100和高浓度表面活性剂为主要试剂)处理,简化了处理步骤,模板不需纯化即可进行扩增,使得处理时间缩短为1 h,并且提高了检测灵敏度。Chelex-100是一种弱阳离子螯合树脂,对多价金属离子有极强亲和力。可螯合一些在高温、低离子强度下使DNA降解的金属离子,在提取DNA过程中可防止DNA降解。还可结合抑制PCR反应的物质,使PCR敏感性增加^〔8〕。 在PCR反应体系方面,选择弓形虫B1基因为目的基因,因为 B1基因是弓形虫各虫期均有的基因,应用最为稳定、广泛,而且由于其在虫体基因组DNA上有35个重复序列,具有较高的灵敏度和特异性^{〔9, 10〕}。同时,通过对PCR扩增条件包括引物浓度、退火温度及循环次数等进一步优化,利于提高检出率和特异性。与传统方法比较,一次可以处理大量样品,具有实用价值。

志谢交通大学医学院徐大刚教授、同济大学李军老师在弓形虫弱毒株引种方面给予大力支持,深表谢。