根据2009年国际病毒分类委员会(ICTV)冠状病毒研究组建议的分类,目前已知有5种人冠状病毒,即人冠状病毒 229E (human coronavirus 229E)、β冠状病毒1(beta-coronavirus 1)、人冠状病毒NL63(human coronavirus NL63)、人冠状病毒HKU1(human coronavirus HKU1)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus,SARSr-CoV)^{〔1, 2〕}。目前所知,冠状病毒与人和动物的许多疾病有关,是引起成人感冒的主要病原之一,同时也是成人慢性气管炎急性加重的重要病原^{〔3, 4〕}。2009年11月下旬,内蒙古自治区赤峰市出现散发重症肺炎病例,临床症状主要表现为发热、咳嗽、胸闷、气促等。流行病学调查结果显示,患者在发病前后均无外出史,相互间也无流行病学关联性,因此排除严重急性呼吸综合征(SARS)感染的可能。为了确定感染者的病原学特征,本实验室采集10例重症肺炎患者的咽拭子样本,进行流感病毒核酸检测和呼吸道病毒多重PCR检测鉴定,并对上述除SARS之外其他4种人冠状病毒的pol基因进行扩增与测序,通过pol基因的系统发育树分析,最终确定了病原的分类地位。现将结果报告如下。

收集2009年11月下旬赤峰市出现的10例重症肺炎散发患者,其中男性3例,女性7例,年龄5~38岁,多数患者初期在家或在当地门诊、乡镇卫生院及旗县医院治疗,后转入市区医院住院治疗,均有重症肺炎表现。

(1)样本:采集10例重症肺炎患者的咽拭子样本,保存于无菌病毒采样液中,按照相关生物安全要求及时运送至实验室。(2)主要试剂:病毒核酸提取试剂盒(viral nucleic acid extraction kit Ⅱ,台湾Geneaid公司);Seeplex^® 呼吸道病毒检测试剂盒(Seeplex (r) RV12 ACE Detection,韩国Seegene 公司);RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit (加拿大Fermentas公司);一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT- PCR)试剂盒(QIAGEN^® One step RT-PCR Kit,德国QIAGEN 公司)。(3)引物:流感病毒核酸检测引物参见文献〔5, 6〕,人冠状病毒pol基因检测引物和测序引物参见文献〔7〕和〔8〕,引物序列如下:(1) HKU1 pol基因:HKU1-F 5'- AAAGGATGTTGACAACCCTGTT-3',HKU1-R 5'-ATCATCATACTAAAATGCTTACA -3';(2) OC43 pol基因:OC43-F 5'-CTGGGATGATATGTTACGCCG-3',OC43-R 5'-TATTCTGTGACAAAGGTTG -3';(3)229E pol基因:229E-F 5'- GTGTGATAGAGCTATGCCCTCA-3',229E-R 5'-GTAACCAAGTCCAGCATAAGTT -3';(4) NL63 pol基因:NL63-F 5' -AATAATATGTTGCGTACTTTA-3',NL63-R 5'-TCATTGAAAAATGTTTCCTA -3';(5) HKU1 pol基因测序引物:F 5' -GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA-3'及R 5'-CCATCATCAGATAGAATCATCATA -3'。

采用病毒核酸提取试剂盒从10 例患者咽拭子样本中提取病毒核酸,并保存于-20℃。采用一步法RT-PCR试剂盒检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、 甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、H5亚型流感病毒及甲型 H1N1流感病毒的HA基因,具体方法参照文献〔5, 6〕。

采用Seeplex^®呼吸道病毒检测试剂盒,以1.2.2中提取的核酸为模板,建立多重PCR 反应系统检测呼吸道病毒,包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、偏肺病毒、一型副流感病毒、二型副流感病毒、三型副流感病毒、人冠状病毒229E/NL63、人冠状病毒OC43/ HKU1、人鼻病毒A/B、人呼吸道合胞病毒A和人呼吸道合胞病毒B。

采用一步法RT-PCR,以 1.2.1中的4对pol基因检测引物特异性扩增人冠状病毒 OC43、299E、NL63和HKU1的pol基因。(1)扩增反应体系: RNase free water 28.8 μL,5 × RT-PCR buffer 10 μL,10 mmol/ L dNTP mixture 2 μL,RT-PCR enzyme mix 2 μL,RNase inhibitor 0.2 μL,20 μmol/L正向引物1 μL,20 μmol/L反向引物1 μL及5 μL模板。(2)扩增条件:50℃ 30 min,95℃ 15 min,94℃ 1 min,48℃ 1 min,72℃ 1 min,返回第3步共扩增40 个循环,72℃ 10 min,4℃ 10 min。PCR扩增产物经电泳和凝胶成像进行检测。

采用人冠状病毒HKU1 pol基因测序引物,以1.2.4中检测阳性的核酸为模板,扩增pol基因片段。RT-PCR扩增反应体系和反应条件同1.2.4。将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。冠状病毒pol基因的参比序列均从GenBank中获取。测序所得序列及参比序列均采用DNAMAN软件保存,采用Clustal W软件进行序列比对,使用Mega4软件用邻接法 (neighbour-joining)和Kimura 2-parameter模型构建系统发育树,自展值(bootstrap)为1 000。

10份咽拭子样本的核酸提取物均未扩增到特异性流感病毒HA基因目的片段,因此判定10例患者咽拭子样本均为流感病毒阴性。呼吸道病毒多重PCR检测结果显示,1 份样本为人冠状病毒OC43/HKU1 阳性,其他9份样本均为阴性。

图 1

注:N:阴性对照,1 :OC43;2:229E;3:NL63;4:HKU1;M:DNA Marker。 图 1 人冠状病毒pol 基因PCR 产物电泳图

采用1.2.1中的4对人冠状病毒pol基因引物检测结果显示,上述1份人冠状病毒OC43/HKU1阳性样本未扩增到人冠状病毒OC43、229E和 NL63的pol基因特异性目的片段,但扩增到大小约440 bp的人冠状病毒HKU1的pol基因目的片段。初步判断该样本为人冠状病毒HKU1阳性,并将该病毒命名为Human coronavirus HKU1 NMG01。

图 2

图 2 pol 基因系统发育树

上述人冠状病毒 HKU1阳性样本用HKU1 pol基因测序引物扩增得到约400 bp的目的基因片段,进行序列测定并与参比序列构建系统发育树。图 2可见,pol基因序列系统发育树由4个分支构成,实验株human coronavirus HKU1 NMG01位于human coronavirus HKU1分支内,与该分支内的参比毒株高度同源。实验株 human coronavirus HKU1 NMG01与参比株human coronavirus HKU1 N18及human coronavirus HKU1 N24的同源性最高,为 100%,与首次被发现的human coronavirus HKU1(序列号NC_ 006577)的同源性为99.7%。

本研究结果显示,10份重症肺炎患者的咽拭子样本中检出1份人冠状病毒HKU1阳性样本,pol基因RT-PCR扩增特异性片段长度约440 bp,命名该阳性样本的病毒为human coronavirus HKU1 NMG01。序列测定及系统发育树同源性分析结果表明,该阳性样本的病毒pol基因与人冠状病毒HKU1 参比毒株的pol基因序列高度同源,最高达99.7%以上。

2005年,中国香港学者Woo等^〔7〕通过RT-PCR法从71 岁肺炎患者的鼻咽抽提物中检测到1种新的冠状病毒,命名为COV-HKU1。随后,法国、澳大利亚、美国及中国等国家的学者也相继报道了HKU1感染的病例^{〔9, 10, 11, 12〕}。感染人冠状病毒HKU1患者的临床症状与其他冠状病毒感染类似,主要表现为上呼吸道感染,但是有时也可能有肺炎、支气管炎或加剧哮喘等症状出现,并且可能恶化患有基础疾病患者的健康状况^{〔7, 8, 13, 14, 15〕}。在法国学者Vabret等报道的6例人冠状病毒 HKU1感染者中大多数有上呼吸道感染症状,但其中3例伴有严重的肠道感染症状,而且从其中2例患者粪便中检测到人冠状病毒HKU1,因此推测人冠状病毒HKU1也许也会引起肠道疾病^〔12〕。本研究中,人冠状病毒HKU1阳性样本的患者表现为上呼吸道感染症状,并最终进展为重症肺炎,这与上述报道的大多数人冠状病毒HKU1感染者症状相似,但该患者并无肠道感染症状出现。

由此表明,本研究中1例重症肺炎患者感染了人冠状病毒HKU1,这也是首次在内蒙古地区检测到人冠状病毒 HKU1。但是,10份样本中只有1份样本阳性,值得进一步研究本地区人冠状病毒HKU1的致病特点及其与呼吸道感染的相关性。