实验研究以及流行病学调查结果表明,环境雌激素对动物雌激素、睾酮等生理作用有明显协同或拮抗干扰效应,是近年来生殖系统畸形、发育异常、代谢紊乱以及某些恶性肿瘤发病率增加的原因之一^{〔1, 2, 3〕}。因此,建立快速有效的检测方法对于环境雌激素污染的评估和防治十分重要。前期本实验室建立了一套体外评估雌激素类物质生物学效应的ERC (estrogen receptor-DNA probe complex)-PCR方法^〔4〕。利用ERCPCR 体系检测环境雌激素,在形成ERC复合物后,还需进行 DNA探针的纯化、荧光定量PCR等较复杂的步骤,整个实验需耗时2天。因此,本研究利用酶联免疫反应(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)改进了ERC-PCR方法,建立和优化了ERC-ELISA筛选体系,并评估和探讨了ERC-ELISA在环境样品中的检测效能,为环境雌激素污染的评估和监测提供了一种简便、快速、有效的方法。

17β-雌二醇(17β-estradiol,E₂ )、4-4' DDT (4-4'dichlorodiphenyltrichloroethane)、ERα(estrogen receptor α)(美国sigma公司),鼠源anti-ERα(D-12)(美国Santa Cruz公司),Tris、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(瑞士Roche公司),生物素标记的DNA探针COX7RPBiotin ( 其序列5'→3'为:GGCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGGGGTCAAGGTGACCCCCGGGG TCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGGG)(美国ABI公司),Streptavidin-HRP (美国Victor Laboratories公司),显色液、终止液、KHB ST-360型多功能酶标仪(上海科华生物有限公司),其他试剂(北京鼎国生物公司)。

共采集2个环境水样品,分别称为1^#水样和2^#水样。1^#水样采自某加油站旁污水沟内,2 # 水样采自某生活小区景观池塘内,环境水样采集后,5 000 r/min,5min离心,取上清作为检测水样原液。环境水样用去离子水2倍倍比稀释,使环境水样系列浓度为1、2^-1、 2^-2、2^-3、2^-4、2^-5(环境水样原液浓度设为1)。环境水样系列稀释样品作为未知样品进行检测。

用100 μL终浓度为2 μg/mL的鼠源 anti-ERα抗体包被酶标板,4 ℃过夜,洗涤后用含0.2% BSA 和0.1%鲑鱼精DNA的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)封闭酶标板,洗涤晾干备用。终浓度为1 nmo/L的 ERα 20 μL与20 μL系列浓度的雌激素在结合缓冲液中4℃ 孵育1 h,然后37℃孵育30 min;加入50 ng生物素标记的双链DNA结合探针COX7RP-Biotin,37℃孵育10 min,形成配体-ERα-DNA探针复合物(ERC)。将ERC加入预处理的酶标板内,室温30 r/min轻摇2 h,PBS洗涤3次。加入1:300 稀释的Streptavidin-HRP 50 μL,37℃孵育30 min。PBS洗涤 3次。显色剂A、B各50 μL,37℃显色20 min,50 μL终止液终止显色反应,混匀后在酶标仪上采取450 nm和630 nm双波长测定吸光度。以不加雌激素作阴性对照,所有受试样本均做复孔。

以相对吸光度来反映E₂ 的相对结合量(相对吸光度△A=A (样本)-A (阴性对照)),用SPSS 13.0统计软件进行剂量效应曲线拟合,并计算半数有效浓度(median effective concentration,EC₅₀ )。

与ERC-PCR检测体系比较,在建立ERC-ELISA检测体系的过程中,结合 ELISA反应的特点,用生物素标记DNA结合探针,得到探针 COX7RP-biotin;通过包被一抗将ERC的结合载体从磁珠转换成酶标板,同时对实验条件进行了优化。

表 1

表 1 不同E2浓度及ERα 抗体浓度下吸光度值比较

表 1 不同E2浓度及ERα 抗体浓度下吸光度值比较

在相同的 E₂ 浓度下,鼠源anti-ERα抗体的包被浓度越高,HRP (horseradish peroxidase)催化底物显色后溶液的吸光度值越高。但同时使不加E₂ 的阴性对照孔的吸光度值也升高,综合考虑增大样本的吸光度值及降低背景的非特异性吸附,所以鼠源 anti-ERα抗体的最佳包被浓度为2 μg/mL。

表 2

表 2 不同结合探针浓度与酶浓度下吸光度值比较

表 2 不同结合探针浓度与酶浓度下吸光度值比较

生物素标记的结合探针COX7RP-biotin与辣根过氧化物酶标记的链亲和素streptavidin-HRP在检测体系中存在上下游的结合关系,两者的使用浓度是相互依存的,所以需要进行COX7RP-biotin和streptavidin-HRP最佳浓度组合的优化实验。该优化过程所采用的E₂ 浓度均为10^-8 mol/L,同时做不加E₂ 的空白对照,结果以10^-8 mol/L E₂ 的相对吸光度表示,E₂ 的相对吸光度△A=A (10^-8mol/L E₂ )-A (阴性对照)。 当COX7RP-biotin浓度为50 ng/ul、streptavidin-HRP 300倍稀释时,E₂ 的相对吸光度最大,表明在这一浓度组合下,COX7RP-biotin既能有效的捕捉E₂-ERα复合物,同时又能够被streptavidin-HRP充分结合发生显色反应,即最优组合为 COX7RP-biotin 50 ng/μL、streptavidin-HRP 300倍稀释。另外对封闭时间(40 min、1 h)、ERα与一抗结合条件(室温30 r/ min轻摇1 h、室温30 r/min轻摇2 h、37℃孵育1 h、37℃孵育2 h)、洗涤次数(3次、6次、9次)等条件进行了探索,最终建立了1.3所述的实验体系。

图 1

图 1 激素类物质的剂量－效应曲线

用系列浓度的环境激素类物质,包括E₂ 和DDT,在ERC-ELISA检测体系中探索了其剂量-效应曲线。结果表明,E₂ 和DDT 对ERE的结合均存在明显的剂量-效应关系,其半数有效浓度EC₅₀ 分别为112、223 pmol/L。最低检测限E₂ 可达1 × 10^-11mol/L,DDT可达到1 × 10^-12 mol/L。E₂ 线性范围为 1 × 10^-11~1 × 10^-9mol/L。

图 2

图 2 环境水样品剂量－效应结合曲线

结果显示,环境水样品的半数有效浓度EC₅₀ 定义为吸光度与112 pmol/L E₂ (E₂ 的EC₅₀ 值)相等时的浓度,则环境水样品的类雌激素效应 EEQ=EC₅₀ (E₂ )/EC₅₀ (样本)。1#和2#水样的EC₅₀ 分别为 0.042、0.104,则其类雌激素效应分别为2.67和1.08 nmol/L。2 号水样采自某小区景观池塘内,水源主要为雨水,而且无其他污染源,所以其类雌激素污染要小于加油站旁污水沟内的污水。

环境雌激素污染的日益严重及其可能产生的生物学效应,使其受到社会各界的广泛关注,因此各国学者一直致力于探索更快速灵敏的高通量环境雌激素测评体系。本研究是基于ERC复合物的形成,利用生物素-链亲和素结合系统和辣根过氧化物酶显色体系而建立的。在本研究中,探讨了E₂、 DDT的剂量-效应曲线,该体系对E₂ 的检测效能高于Gaido 等^〔6〕的重组酵母测评体系[EC₅₀ (E₂ )=225 pmol/L],但不及 ERC-PCR体系[其EC₅₀ (E₂ )=19.9 pmol/L],在一定程度上反映出酶联免疫反应对痕量物质的放大作用不及PCR反应。 在该检测体系中,E₂ 的线性范围与Gaido等^〔7〕的重组酵母测评体系相同。

与ERC-PCR法比较,本检测体系缩短了实验时间,具有通量高、耗时短等优点。而相对于重组基因酵母法,避免了酵母的培养和锥形瓶大量使用带来的不便,并且实验过程不依赖于其他生物体的作用(如酵母),提高了实验结果的稳定性。本检测体系尚有待进一步的改进和优化,增加特异性结合、拓宽线性范围、提高灵敏度仍是不断努力的目标。目前,本体系只对E₂ 和DDT的剂量-效应曲线进行了探讨,后期还需要通过检测其他雌激素类物质来进一步论证本检测系统的有效性,同时通过对其他环境样品的雌激素污染程度的评估以进行本方法的应用研究。