伴随石油工业的发展,石油烃污染及其环境治理问题被广泛关注。石油污染不仅对生态环境和人类健康带来巨大危害,也给国家和社会造成巨大的经济损失^〔1〕。目前在石油污染的治理方法中,微生物修复技术被认为是最具有应用前景的修复技术。本研究在新疆克拉玛依油田采集油污土壤进行石油降解菌的分离鉴定,筛选具有降解能力的菌株,构建本源石油降解微生物菌群,研究其降解机制和特性,为利用本源微生物资源进行微生物修复提供基础资料。

选择新疆克拉玛依油田克东区和克西区等地油污土壤,在离地表深度为10 cm左右,采集土壤标本 1 000 g,装入无菌袋中密闭保存备用。

筛选、分离菌种所用的石油碳源取自克拉玛依油田的脱水原油,为黑色粘稠液体。以石油醚(60~90沸程) 为溶剂,将该脱水原油溶解,配制成一定浓度的溶液备用。

(1)富集用无机盐液体培养基:NaNO₃ 1.5 g,(NH₄ )₂SO₄ 1.5 g,K₂HPO₄ 1 g,MgSO₄·7H₂O 0.5 g,KCl 0.5 g,FeSO₄·7H₂O 0.01 g,CaCl₂ 0.002 g,蒸馏水1 000 mL,微量元素溶液1 mL;pH 7.2。(2)驯化筛选培养基:无机盐培养基+原油溶液。(3)分离培养基:无机盐培养基1 000 mL,原油3 g,琼脂18 g。高压蒸汽灭菌后,倒平板备用。 (4)保存培养基:牛肉膏1 g,蛋白胨10 g,NaCl 1.5 g,原油3 g,琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.2~7.4,高压蒸汽灭菌后,制成斜面备用。(5)微量元素溶液:ZnSO₄·7H₂O 0.2 g,FeSO₄·7H₂O 0.5 g,CaCl₂ 3.0 g,MnSO₄·H₂O 0.06 g,蒸馏水 1 000 mL。

DNA抽提试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNA Marker、PCR试剂盒(上海Generay公司);引物由上海生工公司合成;GNP-9080隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司);ZHJH-C1109B超净工作台(上海智域分析仪器制造有限公司);SHA-B水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司);TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂);PCR仪以及Gel-Doc2000型凝胶成像仪(美国BIO RAD公司)。

来源于GenBank,各个参考株和登陆号: Agrobacterium tumefaciens-AY364329,Arthrobacter gandavensis- AM237357,Planococcus sp.-DQ172994,Planomicrobium sp- FJ265708,Pseudomonas reactans-FJ972537,Pseudomonas sp.- AJ704788,Pseudomonas stutzeri-DQ289057,Psychrobacter maritimus- NR_027225。

取10 g土壤样本加灭菌的蒸馏水90 mL浸泡并曝气24 h,静止沉淀2 h后,上清液外观为棕褐色液体,以上清液作为菌源。

及分离纯化参照文献〔2〕将5 mL 菌源加入100 mg/mL富集含油培养基中,30℃ 160 r/min干热摇床振荡培养7 d。待培养液浑浊后,先取5 mL富集后的培养液倒入含有200 mg/mL原油的新鲜养液中,培养1个周期,然后从中取出5 mL培养液加入300 mg/mL原油浓度的培养液中,再培养1个周期。经过5个周期的驯化后,在无菌条件下,用接种环蘸取培养液,在分离培养基的平板上划线后,将平板倒置于30℃培养箱培养3 d,然后将典型菌落在分离培养基的平板上反复划线纯化后得到单一菌落,再将纯化后的单一菌株接种至保存培养基的斜面上,4 ℃保存。

(1)石油降解菌总DNA提取:取适量的指数生长期细菌,按细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 说明书提取DNA,-20℃保存备用。(2)石油降解菌株16S rRNA的PCR扩增:特异性引物参照文献〔3〕设计。ubac27F: 5'-AGAGTITGATCCTCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3'。扩增体系参照即用型高保真PCR试剂盒说明书,其中DNA模板2 μL (内含基因组DNA400 ng),10 pmol/μL上下游引物各0.5 μL,2 × Pfu Master Mix 25 μL,无菌双蒸水22 μL,共50 μL体系。扩增条件:预变性94℃ 5 min;变性94℃ 1 min;退火50℃ 1 min;延伸 72℃ 2 min 30 s,30个循环,后延伸72℃ 10 min。PCR 产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,紫外下照相,对扩增阳性的产物,进行测序。(3)16 S rDNA序列测定及同源性分析PCR产物送上海生物工程技术服务有限公司进行测定,序列信息输入NCBI数据库进行BLASTN分析。利用DNASTAR软件中的MegAlign软件和Clustal W算法,对分离菌株的16 SrDNA与GeneBank中的参考株进行序列比对,分析其亲缘进化关系。

经过富集培养从新疆克拉玛依油田油污土壤样品中分离到18株能以石油作为唯一碳源生长的石油降解细菌。

通过分离培养,利用NCBI 的BLAST工具,获得了18株菌株的亲缘关系相近的种属,相似性均> 98%。18株降解石油菌株分别属于假单胞菌属 (Pseudomonas sp.)、动性球菌属(Planococcus sp.)、节杆菌属 (Arthrobacter sp.)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、土壤杆菌属 (Agrobacterium sp.)和短波单胞菌(Brevundimonas sp.)。其中假单胞菌属的菌株占绝对优势,分离到13株,占72.2%,其他菌属的菌株则相对较少。空白对照土壤样品中仅分离到了 4株假单胞菌;废弃近20年的油井附近土壤中分离出的菌株包括1株假单胞菌和1株动性球菌属,接近空白对照组;工作井附近油污土壤中分离出13株菌,其中假单胞菌8株。可见在含油量较高的地点,分离的石油降解菌的种类和数量增加,主要菌种为假单胞菌。

利用DNASTAR 的MegAlign分析软件,对18株分离降解菌与参考株进行亲缘关系比较,结果显示,编号1、3、13、19、35、47和52降解菌与Pseudomonas stutzeri亲缘关系较为接近,同源性 98.3%~100%;编号40和50降解菌与Pseudomonas reactans 亲缘关系较为接近,同源性97.2%~98.5%;编号33-2降解菌与Psychrobacter maritimus同源性为99.4%;编号32降解菌与Planococcus sp.同源性为97.7%;编号17降解菌与Planomicrobium sp.同源性为98%;编号53降解菌与Arthrobacter gandavensis同源性为99.4%;编号6降解菌与Agrobacterium tumefaciens同源性为98.1%;编号25、30、37和51降解菌与Pseudomonas sp.亲缘关系较为接近,同源性96.3% ~98.8%。

随着石油工业的迅速发展,各种石油污染物正日益威胁着人类的生存环境,寻找和开发一种有效的石油污染治理方法迫在眉睫,而微生物处理技术由于生产费用低和不产生二次污染被视为一项具有广阔前景的高新技术。在自然状态下,许多微生物对土壤中的有害物质均有降解作用^〔4〕,其中许多种属的微生物能以石油或其化工产品为碳源和能源,因此具有分解和转化石油组分的能力。已报道的能够降解石油的菌种有:Rhodococcus rhodochrous E,Pseudomonas,Alcaligenes,Rhodococcus erythropolis,Acinetobacter,Devouroil等,并广泛分布于受石油污染的环境中^{〔5, 6, 7, 8〕}。本研究从新疆克拉玛依油田油污土壤中分离得到18株石油降解菌,并对所有菌株进行了 16SrDNA序列分析,经初步鉴定分属假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、动性球菌属(Planococcus sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、土壤杆菌属 (Agrobacterium sp.)。其中假单胞菌属是8个石油污染土壤样品中的优势种群。

假单胞菌属于Proteobacteria的γ亚群,拉丁学名为 Pseudomonas Migula (1894),直或微弯的杆菌,0.5~1.0 × 1.5 ~5.0 μm,广泛分布于自然界,该属中的一些种或菌株具有特殊的代谢能力,可以降解各种各样的化合物,如石油、多氯联苯(PCB)等,成为环境保护、生物修复中有应用潜力的菌株^〔9〕。在不同的气候和环境中分离出的石油降解菌也包括假单胞菌株,可见该菌对环境的适应能力极强^{〔10, 11〕}。本研究结果显示,空白对照土壤中降解菌数量较少,随着石油含量的增加,降解菌的数量也在增加。

新疆具有丰富的石油资源,是重要的石油开发生产基地。 在油田勘探和打井采油过程中造成一定数量原油的泄漏。克拉玛依油田位于准噶尔盆地,为碱性和干燥的沙性土壤,油田分布地区干旱缺水,植被稀少,风沙强烈,生态环境十分脆弱,如果石油污染问题不得到重视和及时处理,在石油创造产值的同时带来的是不可估量的生态破坏后果,使环境进一步恶化,同时对人体健康带来不良影响^〔12〕。因此,本研究从当地污染土壤中筛选具有烃降解能力的细菌,不仅为石油污染土壤的微生物修复提供了新菌种资源,而且为今后利用本源微生物处理新疆石油污染土壤建立科学依据和理论基础。