聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是目前最常用的病原菌分子生物学检测方法。近年来在PCR的基础上发展了多重PCR (multiplex PCR,MPCR)技术,能在同一反应体系中同时对多个目的基因片段进行检测,进一步缩短了检测时间并提高了检测效率。针对重庆市病原微生物的分布情况,建立一种快速、灵敏、特异的多重PCR检测方法,对突发疫情的可疑样品,病人标本同时进行副溶血弧菌、沙门菌、霍乱弧菌3种病原菌的检测,有利于及时准确的确定重庆市细菌性突发公共卫生事件的病原菌。本研究通过优化方法,初步建立了能够在20 h内快速、灵敏、特异检测上述3种病原菌的多重PCR体系。

目的菌:副溶血弧菌、O1霍乱弧菌、鼠伤寒沙门菌、都柏林沙门菌、德尔卑沙门菌。参照菌株:大肠埃希菌ATCC25922、枸橼酸杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏2a志贺菌、痢疾志贺菌1型、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌。以上菌株均来自重庆市疾病预防控制中心菌种室。

Taq DNA聚合酶、PCR Buffer (Mg²⁺free)、MgCl₂、 三磷酸脱氧核糖核苷(deoxyribonucleoside triphosphate dNTP) mixture、DNA marker (生工生物工程上海有限公司);琼脂糖 (进口分装);所用营养肉汤、亚硒酸盐半胱氨酸增菌液、碱性蛋白胨水、营养琼脂、4号琼脂、麦康凯琼脂采用北京陆桥技术有限责任公司成品配制;副溶血弧菌选择性培养基、沙门菌选择性培养基采用法国科玛嘉公司成品配制。

PTC-200型PCR仪(美国MJ Research公司); GDS-8000型凝胶成像系统(美国UVP公司);DYY-2C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

查阅文献^{〔1, 2, 3〕}资料及Gene bank搜索,确定选择霍乱毒素(cholera toxin,CT) ctx基因,产物长度为708 bp;副溶血弧菌耐热直接溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH) gyrB基因,产物长度为285 bp;沙门菌invA基因,产物长度为389 bp,从Genebank下载各基因序列后采用Primer premier 5.0软件辅助引物设计。共设计3对引物,由上海生工生物工程有限公司进行引物合成。引物序列为:ctx-1:5'- TTAGGGGCATACAGTCCTCATCCA-3',ctx-2:5'-TGCAATCCTCAGGGTATCCTTCATC- 3',gyrB-1:-5'-CGGCGTGGGTGT TTCGGTAGT- 3',gyrB-2:5'-TCCCCTTCCCGCTCATCAATA-3';invA- 1:5'-GCTGCGCGCGAAC-GGCGAAG-3',invA-2:5'-TCCCGGCAGAGTTCCCATT- 3'。

将细菌通过相应增菌液36℃增菌培养 24 h后,吸取上述增菌液1 mL于1.5 mL离心管中,13 000 r/min 离心3 min,弃去上清后用1 mL超纯水重悬沉淀,沸水浴15 min,13 000 r/min离心30 s,置-20℃备用。

PCR反应的物质主要有5 种,分别是引物、酶、dNTP、模板和Mg²⁺,根据长期实验经验,模板的最适范围为0.1~2 μg,最低可以检测到1 pg;引物最适浓度范围为0.5~1.0 mmol/L,最低可达10 pmol/L;Mg²⁺ 最适浓度范围为1.5~2.0 mmol/L;dNTPs最适浓度范围为 50~200 μmol/L;Taq酶的量为2.5 U左右。首先设计一个 L16(54)正交实验,确定各物质最适量,然后对影响因素较大的Mg²⁺按照正交设计的结果再进行一个单因素分析实验微调。反应条件中退火温度最为重要,因此进行一个梯度实验确定其优化方案。

将要检测的3种标准菌株分别复苏,在平板上划线接种,培养24 h后,挑取单个菌落采用 0.85%无菌生理盐水制作菌悬液,采用煮沸法提取DNA,通过PCR扩增,凝胶电泳,得到各自的目的基因片段,经过DNA 测序仪测序验证片段的正确性。

分别用目的菌株和参照菌株制备模板,在优化后的多重PCR体系条件下扩增,电泳检测产物。

将副溶血弧菌、沙门菌和霍乱弧菌3种致病菌的标准菌株分别用相应增菌液36℃增菌24 h后,将增菌液进行梯度稀释,得到10^-1~10^-6倍比稀释菌液,每个梯度的菌液分别取0.1 mL涂抹于营养琼脂平板 (副溶血弧菌涂抹3%氯化钠营养琼脂平板),36℃培养24 h 后计数;同时各梯度菌液分别取1 mL离心煮沸提取模板,进行多重PCR扩增。能检出的最低细菌浓度为该多重PCR体系的灵敏度。

图 1

注:M:Marker;1:阴性对照;2:副溶血弧菌;3:霍乱弧菌;4:沙门菌。 图 1 目的基因PCR 电泳结果

标准菌株DNA模板通过PCR 扩增,电泳条带与目的基因大小一致。将测序结果与目的片段用Multalin软件比对其同源性,发现扩增结果与目的基因片段的同源性较高,说明这3对引物能正确扩增各目的基因。

经过正交实验和单因素分析实验,对反应中Mg²⁺离子浓度及退火温度进行优化,确定多重PCR的最佳反应体系为:在25 μL的反应体系中 25 mmol/L MgC1₂ 2.5 μL,10 × PCR缓冲液2.5 μL,10 mmol/μL dNTP 0.5 μL,Taq DNA聚合(2.5U)0.5 μL,适当浓度的上、下游引物,模板各1 μL。PCR扩增条件为:94℃ 变性5 min,然后94℃变性45 s,58℃退火40 s,72℃延伸1 min,共进行35个循环,最后再经72℃延伸10 min后,于4℃ 结束反应。

图 2

注:M:DL1000Marker;1:副溶血弧菌;2:鼠伤寒沙门菌;3:都柏林 沙门菌;4:德尔卑沙门菌;5:福氏2a志贺菌;6:痢疾志贺菌1型;7:鲍 氏志贺菌;8:霍乱弧菌;9:宋内志贺菌;10:大肠埃希菌;11:枸橼酸杆 菌;12:变形杆菌;13:阴性对照 图 2 多重PCR 特异性检测结果

对所提取的13个菌株的DNA用4种菌的混合引物进行PCR检测,其中3株沙门菌、1株霍乱弧菌、1株副溶血弧菌全部显示阳性,另外8株阴性。从图中可以发现无非特异性条带出现,其他种属细菌未出现扩增带,说明3对引物具有很强的特异性。

以10倍系列稀释的沙门菌、 副溶血弧菌、霍乱弧菌标准菌株DNA为模板,进行invA基因、gyrB基因、ctx基因的PCR扩增,结果显示,副溶血弧菌、 沙门菌和霍乱弧菌的检测灵敏度均能达到10pg/μL水平。

对沙门菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌检测靶基因的选择,很多研究报道采用不同的毒力基因^{〔4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12〕}。本研究采用了沙门菌的invA基因、副溶血弧菌的gyrB、霍乱弧菌的ctx基因进行引物设计。本研究在与传统方法检测的对比过程中,未发现假阳性出现,分析原因与引物序列特异性比较强,操作过程中符合规范要求,未出现污染有关。多重PCR的敏感性实验结果表明,该体系最低能检测10pg/μL副溶血弧菌、沙门菌和霍乱弧菌的DNA模板,表明该多重PCR与常规PCR一样,均具有很高的敏感性,可以直接用于临床样品中副溶血弧菌,沙门菌和霍乱弧菌的检测和鉴别。具有比较广阔的应用前景,对食品安全、人群保护有着不可忽视的公共卫生意义。PCR 的假阴性问题几乎涉及了PCR实验的所有环境、人员和技术各个环节,十分复杂,本研究中未发现由仪器、试剂、人员等方面原因引起的假阴性试验。但在模板稀释过程中发现模板浓度较低的情况下,由于其他干扰物质的干扰,试验会出现假阴性结果。