急性毒性试验是毒理学安全性评价第一阶段基础性试验,是毒理学安全性评价制订卫生管理标准不可或缺的重要依据^〔1〕,其主要目的是求出受试化合物对试验动物的半数致死剂量(LD₅₀ )。传统急性毒性试验虽然可较精确测量LD₅₀ ,但以死亡为其观察终点,使用动物较多,工作量较大,耗费较多人力物力。随着近年动物"3R"(减少reduction,优化refinement,替代replacement)原则的提出和人类对动物福利的关注,以动物模式为基础的毒理学研究系统和评价方法逐渐受到挑战,动物替代试验方法备受关注。本研究对近年急性毒性体内和体外替代方法进展综述如下。

与传统急性毒性试验获取精确半数动物死亡的LD₅₀ 值不同的是,急性毒性测试的体内替代方法采用整体动物但不要求以动物死亡为终点,以"表现严重中毒,如再升高剂量则将会死亡"的效应作为评价依据进行体内试验评价急性毒性。该方法主要体现3R中的"减少"原则。20世纪80年代一些国家相继成立替代法组织,并举行替代法国际会议,在会议上提出替代传统LD₅₀ 测试法的急性毒性体内替代方法,并陆续被官方所采纳和支持。目前经济合作与发展组织 (OECD)推荐的急性毒性测试的体内替代方法主要有固定剂量法、急性毒性分级法和上-下移动法。

固定剂量法(fixed dose procedure,FDP)由英国毒理学会于1984年正式提出,该方法观察在一系列固定剂量水平下的毒性反应,按毒性症状来判断受试化合物的毒性及对受试化合物的毒性进行分级,不以动物死亡为终点^〔2〕。1992年7月OECD将固定剂量法作为传统急性毒性试验的第一种替代方法引入化合物的试验指南TG420中。 该方法包括主试验和限度试验。在主试验中,成组的单性别动物顺次间隔一定时间进行5、50、300、2 000 mg/kg固定剂量的毒性测试,而始剂量水平是基于预试验选择的预期产生毒性症状但无严重的毒性效应或死亡的剂量。根据是否出现毒性症状或死亡,下一组动物给予更高或更低的固定剂量。如动物出现严重反应或遭受痛苦时应出于人道观念处死动物,并利用下一组动物继续较低剂量的试验,直至引起明显的毒性效应或不再出现死亡或在最高剂量下未观察到毒性效应或在最低剂量下发生死亡时终止试验。当有资料表明受试化合物可能无毒时进行限度试验,否则进行主试验。如2000 mg/kg 处理无毒性反应出现,则再进行1次2 000 mg/kg限度试验,仍无毒性反应出现且动物全部存活即可终止试验^〔3〕。

固定剂量法与传统急性毒性试验方法相比较在评价毒性及毒性分级方面无明显差异,可用其代替传统的急性毒性试验方法用于评价急性毒性,并且可为危险度评价提供足够的急性毒性试验资料。1990年OECD组织了11个不同国家的 31个实验室采用20种相关化合物对该方法进行国际性验证,结果实验室之间有较好的一致性,得到的数据可以用于危险度评价及化合物的分级^〔4〕。固定剂量法的数学模型已经证明该方法可以重复,且与传统方法相比减轻了动物的痛苦和使用更少的动物量,但应注意该方法并不能得到具体的LD₅₀ 值。

急性毒性分级法(acute toxic class procedure,ATC)于1990年由Sumiey提出,是一种评估化合物急性毒性的简单方法。1996年3月作为传统急性毒性试验的第二种替代方法被引入OECD化合物试验指南TG423中。 急性毒性分级法是一种分阶段试验法,每一步需要单性别的动物(一般为雌性)3只,根据动物的死亡率和垂死状态,一般需要2~4个步骤来判断试验化合物的急性毒性。从5、50、 300、2 000 mg/kg 4个固定剂量水平选择始剂量(始剂量应该是最可能引起动物死亡的剂量水平)。根据每一步是否出现化合物相关的动物死亡决定下一步试验的方法,包括①不需要进一步的试验;②另外3只动物的同一剂量试验;③另外3 只动物的更高或更低剂量试验。如果可利用的信息表明在最高的始剂量水平不引起动物死亡,则进行限度试验。如果没有受试化合物的信息,出于动物福利的原因,推荐使用300 mg/kg作为始剂量^〔5〕。

传统急性经口毒性试验需用40只动物,而急性毒性分级法所用大鼠一般为7只,因而有效地减少了实验动物的使用量^〔6〕。该法仍以死亡作为试验的观察终点,根据在某一染毒剂量上死亡的数量来判定大致的LD₅₀ 值范围,但无法获得精确的LD₅₀ 值。总体来看,该方法可重复性较好,使用动物较少,并经过了OECD组织的国际性验证研究,是可用于急性毒性评价及毒性分级的一种方法^〔7〕。

上-下移动法(up and down procedure,UDP)是由Dixon和Mood等于1985年利用优选法提出的 LD₅₀ 推测法,即用少数动物来推测大概半数致死剂量,而不要求得到精确致死剂量^〔8〕。2001年OECD将上-下移动法作为传统急性毒性试验的替代方法引入化合物试验指南TG425 中。该方法分为主试验和限度试验。在主试验中,根据受试化合物的剂量级数因子(当缺乏受试化合物剂量反应曲线斜率的相关资料时,使用默认的剂量级数因子3.2)确定剂量序列,第一只动物的剂量为剂量序列中最接近且小于LD₅₀ 估计值的剂量,如果动物存活,下一只动物的剂量等于原始剂量乘以剂量级数因子;如果动物死亡,下一只动物的剂量等于原始剂量除以剂量级数因子。当出现下列3种情况中任何1种时则终止试验:①最高剂量连续3只动物存活;②任何6只动物中有5只连续发生高一级剂量死亡、低一级剂量存活的生死转换;③至少有4只动物发生生死转换以及指定的似然比超过临界值。在限度试验中,受试化合物按2 000 mg/kg给予1 只动物,观察48 h,如果该动物死亡,则进行主试验;如果该动物存活,依次将受试化合物给予另外4只动物。有3只或3 只以上动物存活时,LD₅₀ > 2 000 mg/kg;有≥3只动物死亡时,LD₅₀ < 2000 mg/kg^〔9〕。

上-下移动法仍以死亡为观察终点,根据结果上下增减剂量,采用最大似然数法计算LD₅₀ 值,适合用于动物在48 h 内死亡的化合物,不适用于迟发性死亡(48 h~14 d)。该方法受试化合物需求量少,在药物研发早期筛选化合物时作用明显。

体外急性毒性测试方法是指采用无痛方法处死动物,使用其细胞、组织或器官进行体外试验,将试验结果用于急性毒性评价的一种方法,其中最主要的为细胞毒性试验。细胞毒性试验有多种,基于检测终点之不同,通常分为反映细胞存活率、细胞代谢活性、细胞增殖速度3个方面。细胞毒性试验方法> 1 000种,其中反映细胞存活率的测定方法主要有中性红摄取(neutral red uptake,NRU)试验、台盼蓝拒染(trypan blue exclusion)试验、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放试验;反映细胞代谢活性的测定方法主要有噻唑蓝(MTT)试验、alamar blue还原试验;反映细胞增殖速度的测定方法主要有脱氧胸苷嘧啶(³H-TdR)掺入法、集落形成(colony formation) 试验。

基于活细胞能够吸收和结合中性红染料,中性红细胞毒性试验是一种反映细胞存活率的化学敏感性试验。中性红是一种弱阳离子染料,通过溶酶体内非离子扩散和细胞内积累稳定地穿透细胞膜,改变细胞表面或敏感的溶酶体膜,导致溶酶体的脆性和其他改变逐渐变为不可逆,外源化学物导致的这些改变使得中性红的吸收和结合减少。该染料可使活细胞染成红色,而死细胞不变色,从而能够区分活细胞,损伤或死细胞,渗入活细胞的中性红的量与活细胞数量呈正比^〔10〕。

基础细胞毒性的验证研究表明,BALB/c 3T3(鼠成纤维细胞)中性红摄取(NRU)试验和NHK (人正常角质细胞)中性红摄取试验在急性毒性研究的起始剂量确定中起重要作用^〔11〕。该方法具有良好的稳定性及预测能力,因此推荐作为细胞毒性测试的常用方法。在标准验证程序中BALB/C 3T3 NRU试验是使用最多的细胞毒性试验,有很好的重复性,结果较好;NHK NRU试验虽然应用上少于BALB/C 3T3 NRU试验,但因有较好的灵敏度和特异度而用作筛查工具,并成为成套体外试验的一部分^〔10〕。该方法不适用于无溶酶体的细胞。 王征等^〔12〕选用HepG2人肝癌细胞,运用体外细胞培养技术,分别利用中性红摄取试验、alamar blue还原试验等对47种已知体内急性毒性的化合物进行细胞毒性检测,结果显示中性红摄取试验的检测结果与体内LD₅₀ 的相关性最好,是较好反映体内急性毒性作用的体外检测方法。

正常活细胞胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内;而丧失活性或细胞膜不完整细胞,胞膜通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失,即可认为细胞已经死亡。因此,借助台盼蓝染色可以非常简便、快速区分活细胞和死细胞。台盼蓝拒染试验能够反映细胞的存活率,是组织和细胞培养中最常用的死亡细胞鉴定方法之一,适用于验证有或无膜损伤的细胞数,不适用于检测细胞毒性^〔13〕。该方法虽然方便实用,价格低廉,操作简单,但是染色时间不宜过长,否则部分活细胞也会着色,而干扰计数,试验过程比较耗费精力和时间,且平行样本之间误差较大,因此不适用大样本的检测。

乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的细胞质酶,在胞浆内含量丰富,正常情况下不能透过细胞膜,当细胞受损伤或死亡时由于细胞膜通透性改变会释放到细胞外,此时培养液中LDH的活性与细胞死亡数目呈正比。 该试验通过测量膜的完整性,反映细胞的存活率,其检测细胞毒性效应的能力只限于引起细胞膜直接损伤的物质^〔14〕。LDH 释放试验虽然应用不多,但其是毒性筛查试验中最可靠的。

MTT是一种黄颜色染料,活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时在细胞色素C的作用下,生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(formazan),甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm处进行测定。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,可根据吸光度(A)值推测出活细胞数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶,因此加入MTT 不会有反应。该法简单、快速、经济和无放射性污染等特点已成为细胞生物学及相关研究领域一种分析细胞代谢活性的常用方法^〔15〕。MTT法通过检测细胞线粒体的损伤,反映受试物处理后细胞的即时损伤^〔16〕,其检测结果会随着培养基的变化而变化,从而影响其可重复性,且MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。

Alamar blue染料也叫刃天青(resazurin) ,是一种特殊的活细胞代谢指示剂,易溶于水,进入细胞后经线粒体酶还原产生粉红色的荧光物质,而死细胞丧失了代谢能力则无法产生荧光。刃天青溶液是深蓝色的,活细胞中染料的生物还原作用使得其氧化形式(蓝)数量减少同时荧光中间体(红)数量增加,从而提示了受试物引起细胞毒性的程度^〔17〕。因此该方法是反映细胞代谢活性的。刃天青染料本身对细胞无毒作用,可与细胞共同培养,该方法灵敏度较高,可通过比较实验组和对照组的吸光度改变计算细胞的相对存活率及用于细胞毒性代谢动力学分析。但如果加入的受试化合物可使刃天青染料还原,则会高估细胞的存活率。 因此,进行毒性代谢动力学分析时,要有严格的空白对照,否则结果不可靠。

脱氧胸苷嘧啶(TdR) 是DNA特有的碱基,也是DNA合成的必需物质。用氚标记的TdR (³H-TdR)具有放射性活性,在DNA合成过程中作为 DNA合成的前体掺入DNA链中,通过测定细胞的放射性强度来反映细胞DNA的代谢及细胞增殖状况。根据细胞株在受试化合物干预下的细胞周期选择适当的³H-TdR标记期,可以保证试验结果真实的反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况^〔18〕。该方法客观、重复性好、结果较准确,但操作复杂且存在放射性污染,故在应用中受到限制^〔19〕。

集落形成试验是一种反映细胞增殖能力的试验方法。细胞在培养基中培养7~13 d后,将培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,通过倒置显微镜扫描整个培养基计数大于50个细胞的集落,计算集落形成率并与对照组进行比较,可用于反映细胞的增殖能力及毒性效应是否有剂量依赖性^〔20〕。人宫颈癌细胞S3(SC)和BALB/c 3T3 A31-1-1细胞系的集落形成试验被认为是最敏感的,但变异性也是最大的^〔21〕。该试验的缺点是确定集落有一定难度,重复性较差,比较费时,并且不能在96孔板上进行,以至于不能自动化检测。

近年来,因动物福利和3R原则的提出,急性毒性测试的体内和体外替代方法成为当前研究的热点。中国各类化学物质的急性毒性评价试验正在逐步与OECD现行的试验规范对接,已开始采用固定剂量法、急性毒性分级法或上-下移动法研究各类化学物质的急性毒性。急性毒性的体内替代方法可以大大减少活体动物的用量和饲养所需的人力物力,减轻活体动物的痛苦,缩短试验周期,降低试验成本,提高检测效率。

因体内替代方法只能减少动物的使用量,并非完全禁用动物,许多科学家致力于研究急性毒性测试的体外替代方法。 该方法在药物的研发中使用离体细胞或培养组织,在投药的准确性和结果定量上均显示出其优越性,具有较大经济和社会效益^〔22〕,且完全不使用活体动物,更充分体现了动物福利和3R原则,达到真正的替代。中国对急性毒性测试的体内和体外替代方法的研究尚处于起步阶段,为适应国际发展趋势及动物福利和3R原则的要求,建立适用于中国的急性毒性体内和体外替代方法十分必要和迫切。