脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)污染广泛存在于全球,主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物,也污染粮食制品,如面包、饼干、麦制点心等。人和动物在误食被 DON污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应,其还常与其他的真菌毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物,进入人体后可以相互影响,对人类及动物的健康构成威胁。DON的污染是中国最主要的真菌性食物中毒之一,越来越引起了人们的重视。目前DON的检测方法不同程度存在着样品预处理复杂费时,仪器设备昂贵,检测灵敏度低等缺点^〔1〕。本研究采用直接竞争法建立了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的酶促化学发光免疫分析技术。实现了对粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的快速测定,为应用于卫生检验检疫提供了依据。

发光检测仪(Luminoskan Ascent)及其软件(美国 Thermo公司)。脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品(美国Enzo公司)。辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H₂0₂ )、吐温-20 (Tween 20)(美国Sigma公司);Mouse IgG antibody (HRP)(美国GeneTex公司);化学发光剂(美国Pierce公司)。96孔发光板(上海科恩有限公司);牛血清白蛋白(BSA)(上海赛达生物有限公司产品);实验所用化学试剂均为分析纯。

抗原合成方法参见文献〔2〕。

抗体制备方法参见文献〔3〕。

取100 μL合成抗原包被发光板,4 ℃过夜。包被后用磷酸-吐温缓冲盐溶液(PBST)冲洗1次,用5%脱脂乳封闭发光板。加入50 μL标准品或 50 μL样品和50 μL单抗后,振荡混匀,于37℃温浴。用 PBST冲洗3次后加入100 μL酶标二抗。37℃温浴后冲洗干净,加入100 μL发光剂。以抑制率和脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度做标准曲线,对样品进行测定。选择最大发光值(RLU_max ) 与半抑制率IC₅₀ 比值(RLU_max/IC₅₀ )最大为最优条件,此时灵敏度最高^〔4〕。

图 1

图 1 不同包被抗原浓度下的竞争抑制曲线

用合成抗原BSA-DON包被发光板,包被浓度分别为0.5、1、2、4 μg/mL。单抗浓度稀释倍数为1:20 000,酶标二抗稀释倍数为1:1 000。温浴时间1 h。 结果对应不同包被浓度下的灵敏度分别为10.3、18.8、30.1和 26.4。 选定2 μg/mL作为本方法的最佳包被浓度。

图 2

图 2 不同抗体浓度下的竞争抑制曲线

确定了最佳包被浓度后,将单抗稀释倍数设定为1::10 000、1:20 000、1:40 000。结果对应不同稀释倍数下的灵敏度分别为29、30.1和27.9。选定 1:20 000作为本方法的最佳单抗稀释度。

图 3

图 3 不同反应时间下的竞争抑制曲线

确定了最佳包被浓度,最佳单抗稀释度和最佳酶标二抗稀释倍数后,分别设定不同的反应时间(30、45、60 min)观察发光值的变化。结果对应不同稀释倍数下的灵敏度分别为93.3、61.2和58.8。选择反应时间 30 min。

在不含DON的小麦粉中加入浓度为20、50、 100、200、400 μg/kg的DON标准品,取1 g用10倍体积超纯水浸提,取50 μL进行测定,计算加标回收率为(93 ± 3)%,变异系数为(4.84 ± 1.5)%。

线性范围为5~160 ng/mL。

平行测定10孔零校准品(S0)发光强度,计算平均值和标准差,平均值加减2倍标准差(x±2s)所得的发光值,代入线性方程计算出对应浓度,重复5次,平均灵敏度为 8 ng/mL。

批内精密度3.23%~5.14%,批间精密度 6.06%~8.26%。与黄曲霉毒素B1、桔霉素和赭曲霉毒素的交叉反应率分别为0.03%、0.06%和0.1%。

对1份小麦样品进行倍比稀释,检验稀释度与检测值呈线性相关,得到的相关方程为y=0.291 2 Ln (x)- 0.535 2,相关系数r=0.992 9。

在抗DON单克隆抗体的基础上,已建立了多种DON免疫学检测方法,如酶联免疫吸附检测(ELISA)、荧光极性免疫分析、生物传感器检测法等。ELISA是一种快速检测DON的常用方法,具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品等特点,常用于大量样品的初筛。另外,采用ELISA检测的样品通常不需要净化,但传统的ELISA法由于显色底物本身的特性使检测灵敏度受限。作为痕量分析领域的一个重要研究方向化学发光免疫分析技术已在临床检验和环境检测方面占据了重要地位。本研究将化学发光免疫分析原理(CLIA)应用于赭曲霉毒素A的检测,该技术将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,有效弥补了传统的ELISA灵敏度不高的缺陷。

抗原包被浓度、抗体稀释度和反应时间是影响CLIA的主要因素。本研究采用直接竞争法,分别对4个梯度抗原包被浓度、3个梯度抗体稀释倍数和3个梯度应温浴时间建立竞争抑制曲线。有文献报道RLU_max/IC₅₀ 最大时,灵敏度最高^〔4〕。本研究通过RLU_max/IC₅₀ 选取各因素的最优反应条件为抗原包被浓度为2 μg/mL,抗体稀释倍数为20 000,反应时间为30 min。此条件下建立的竞争抑制曲线相关系数> 0.99,平均灵敏度为8 ng/mL。线性范围为5~160 ng/mL,远比传统ELISA检测的灵敏度高^〔3〕。本技术方法反应时间短,所需样本量仅50 μL,适用于大批量样本检测。所建立的方法有利于提高食品安全检测方法的灵敏度,并为建立其他真菌毒素的化学发光免疫分析方法提供依据。