研究显示,失眠对中枢神经系统的毒性作用包括思维紊乱、反应迟钝、注意力分散、定向障碍、学习记忆受损等,睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)24 h使人的认知能力下降30%~ 40%,持续48 h,认知能力下降达60%~70%^{〔1, 2〕}。研究显示,即刻早期基因c-fos与病理状态下神经细胞损伤呈平行关系;细胞因子IL-1 β在认知功能方面具有重要作用^{〔3, 4〕}。本研究观察不同时间睡眠剥夺对海马区c-fos和IL-1 β表达影响,为控制睡眠剥夺后不良反应提供新思路。

图像采集及图像分析系统(美国Bio- Rad生物仪器设备公司);水迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司);Rotor Gene 3000 PCR仪(美国Corbete Research公司);H-7 650透射电镜(日本日立公司);c-fos和β-actin引物合成(北京奥科生物技术有限责任公司)。c-fos上游引物5'- TGG ACC TGT CTG GTT CCT TC-3',下游引物5'-ATG CAC CAG CTC AGT CAG TG-3';β-actin上游引物5'-TTG TAA CCA ACT GGGACG ATA TGG-3',下游引物5'-GAT CTT GAT CTTCAT GGT GCTAGG-3');IL-1 β试剂盒(美国Santa Cruz公司)。

雄性SD大鼠40只(北京维通利华公司),合格证:SCXK (京)2002-003,体重(330 ± 20) g。将大鼠随机分为对照组(10只),睡眠剥夺组(30只),每组又随机平均分为睡眠剥夺1、3、5 d 3个亚组,每组10只。采用改良多平台法制备快速动眼睡眠剥夺模型^〔5〕。睡眠剥夺箱大小30 cm × 30 cm × 150 cm,其中央放置直径为6 cm,高8 cm 的平台。剥夺箱内注有水,水面低于平台2 cm,水温保在 (20 ± 2)℃。大鼠可以在平台上自由摄取食物和水,但当进入睡眠时于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒,造成睡眠剥夺。对照组除平台增大为直径13 cm,其余因素与睡眠剥夺组一致,大鼠在大平台上可以部分活动,并可以进入睡眠。

各时间点取2只动物常规麻醉,开胸、 暴露心脏,混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸缓冲液)心脏灌流,断头取脑,取大脑海马组织,切成1 mm × 1 mm × 1 mm组织块,戊二醛固定,二甲砷酸缓冲液冲洗2 遍,四氧化锇固定,缓冲液冲洗,逐级丙酮脱水,环氧树脂浸透,包埋,超薄切片,醋酸铀枸橼酸铅双重染色,透射电镜下观察脑组织超微结构并摄片。

(RT-PCR)检测c-fosv mRNA 取大鼠海马区脑组织,液氮冷却。Trizol一步法提取总RNA,反转录为cDNA后进行RT-PCR反应。第1步反应:1个循环,94℃ 2 min;第2步反应:40个循环,95℃ 15 s,60℃ 40 s,并读取荧光值;第3步反应:制作熔解曲线。

取大鼠双侧海马区组织0.6 g,冰浴中匀浆,4 ℃离心后取上清。考马斯亮蓝法测蛋白含量。蛋白样品40 μg与等体积上样缓冲液混合,煮沸 10 min,100 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(IL-1 β 抗体1:1 500),化学发光显影液显色,用图像分析仪测定吸光值,定量分析。

按照文献〔6〕,采用Morris水迷宫进行检测,上午、下午各1次,记录各组大鼠搜索安全岛(即平台)潜伏期时间(s);和撤去平台后动物穿越原平台位置的次数,取均值。

应用SPSS 13.0统计分析软件对数据进行分析,数据以x±s表示,进行方差分析和t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

对照组神经元细胞核大而圆,核膜清晰、完整,粗面内质网、核糖体、微管、高尔基复合体清晰可见,线粒体双膜结构清晰,嵴排列整齐。睡眠剥夺组中,随睡眠剥夺时间延长,神经元出现变性水肿,高尔基体扩张呈大泡状,多聚核糖体解聚,高度肿胀、部分线粒体嵴断裂或空泡化,双膜结构模糊,甚至可见胞核电子密度增高,核膜凹陷等。

图 1

注:A1~A3:对照组1,3 ,5 d;B1~B3:睡眠剥夺1,3 ,5 d。 图 1 c-fos mRNA RT-PCR 电泳结果

提取的总RNA 经紫外分光光度计检测,A 260/A 280均在118~210之间,表明提取的RNA较纯,可用作RT-PCR反应的模板。大鼠海马区c-fos和β-actin mRNA扩增曲线平滑,指数期和平台期明显;熔解曲线重复性较好,无引物二聚体和非特异性扩增,适于做相对定量分析。与对照组比较,睡眠剥夺组中c-fos mRNA 水平在相应时间点明显上调,5 d达高峰(P < 0.05)。

图 2

图 2 IL-1β 蛋白免疫印迹结果

与对照组比较,模型组中 IL-1β蛋白水平在相应时间点明显上调,睡眠剥夺5 d达高峰 (P < 0.05)。

表 1

表 1 各组大鼠水迷宫检测结果(n = 10，x±s)

表 1 各组大鼠水迷宫检测结果(n = 10，x±s)

与对照组比较,睡眠剥夺组大鼠搜索安全岛潜伏期明显延长、穿越原平台位置的次数减少(P < 0.05)。

3 讨 论 本研究采用改良多平台法制作睡眠剥夺模型,主要对动物进行快波睡眠剥夺,结果显示与对照组比较,随睡眠剥夺时间延长,睡眠剥夺组中大鼠海马区神经细胞结构损伤明显,同时大鼠搜索安全岛潜伏期明显延长、穿越原平台位置次数减少,表明睡眠剥夺造成动物神经损伤,认知功能下降,与相关报道一致^{〔1, 2, 5〕}。

c-fos是一类即刻早期基因,正常情况下,中枢神经系统内可有低水平表达。多种刺激因子如缺血、缺氧、疼痛均可刺激c-fos异常表达。李光^〔7〕发现灵芝多糖可改善SD大鼠的空间记忆情况,与降低海马区c-fos表达有关。细胞因子IL-1 β 可通影响脑细胞对神经活性物质的释放和再摄取、调控输入与输出关系的反应环路、影响突触的可塑性等,在认知功能方面具有重要作用^{〔4, 5, 6, 7, 8〕}。朱书秀^〔9〕的研究显示电针改善SD大鼠学习记忆情况、降低海马区IL-1 β的含量。Alson等^〔10〕认为,病理损伤情况下,脑内升高的IL-1 β,可通过减少海马区有关神经营养因子的生成,间接抑制长时程曾强,从而引起记忆缺失和学习障碍。本研究中,与对照组比较,随睡眠剥夺时间延长,c-fos、IL-1 β表达明显增高。结果表明,睡眠剥夺通过促进大鼠海马内导致c-fos基因的异常转录、IL-1 β含量增多,从而导致SD大鼠认知功能障碍。