中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (10): 1281-1283   PDF    
引用本文
黄赞松, 欧平, 黄衍强, 周喜汉, 黄宏思, 李晓华, 黄小凤, 岑朝. 幽门螺杆菌耐药性与细胞毒相关基因A分型关系[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(10): 1281-1283.
HUANG Zan-song, OU Ping, HUANG Yan-qiang, et al. CagA genotype and drug resistance of Helicobacter pyloriHp[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(10): 1281-1283.
幽门螺杆菌耐药性与细胞毒相关基因A分型关系
黄赞松1, 欧平2, 黄衍强3, 周喜汉1, 黄宏思3, 李晓华3, 黄小凤3, 岑朝1    
1. 右江民族医学院消化研究所, 广西百色533000;
2. 广西贺州学院;
3. 右江民族医学院
收稿日期: 2010-06-10.
作者简介: 黄赞松(1962- ),男,广西容县人,教授、主任医师,硕士生导师,硕士,研究方向:消化系疾病诊治、幽门螺杆菌耐药和中药抗肿瘤作用机制研究。
摘要: 目的 探讨对克拉霉素耐药的幽门螺杆菌(Hp)携带细胞毒相关基因A(CagA)状况及其与基因分型的关系。方法 收集右江民族医学院附属医院确诊Hp感染患者的胃窦部黏膜标本482份,进行Hp分离培养和鉴定;采用PCR方法扩增CagA,采用E实验(E-test)进行克拉霉素耐药试验,采用细菌基因组重复性元件序列PCR技术(REP-PCR)方法对携带CagA+的克拉霉素耐药株进行基因分型,运用NTsys2软件进行聚类分析。结果 分离培养出374株Hp,其中CagA阳性87株,阳性率23.3%;随即选取携带CagA基因的克拉霉素耐药的26株Hp,根据78%的相似性分析结果显示,可分成6类基因型,分别是GroupⅠ、Group II、GroupⅢ、GroupⅢ、GroupⅣ、GroupⅤ,GroupⅥ,每类分别有3、3、8、4、6、2株Hp。结论 携带CagA基因的克拉霉素耐药的Hp可分成6类基因型,Hp的克拉霉素耐药性基因分型与CagA基因无密切关联。
关键词: 幽门螺杆菌     耐药性     基因分型     CagA    
CagA genotype and drug resistance of Helicobacter pyloriHp
HUANG Zan-song, OU Ping, HUANG Yan-qiang, et al    
Digestive Diseases Institute, Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000, China
Abstract: Objective To study the genotype of CagA and drug resistance to clarithromycin of Helicobacter pyloriHp (Hp).Methods Hp strains were isolated from 482 gastric mucosa biopsies of patients with peptic ulcer or gastritis in Youjiang Medical College for Nationalities.The amplification of CagA gene fragment was conducted with PCR.Resistance to clarithromycin of Hp was determined with E-test.Meanwhile,strains were genotyped with repetitive extragenic palindromicPCR(REP-PCR)and further clustered with NTsys2 software.Results Totally 374 Hp strains were identified with 87 Hp strains of CagA gene positive and a positive rate of 23.3% (87/374).The 26 CagA gene positive and resistant to clarithromycin strains were divided into six genotype groups according to their 78% homology,with 3,3,8,4,6,2 strains in each Hp group,respectively.Conclusion The CagA gene positive and resistant to clarithromycin strains could be divided into six genotype groups and the resistance to clarithromycin of Hp is not associated with CagA gene.
Key words: Helicobacter pyloriHp     drug-resistance     genotyping     CagA    

随着抗生素在根除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 治疗中的广泛应用,Hp耐药株发生率不断上升,成为导致治疗失败的主要原因。研究表明,Hp的毒力决定于其产生细胞毒相关蛋白(CagA)和空泡毒素(VacA)的能力〔1〕。提示CagA 基因与Hp的毒力密切相关,是重要的毒力因子之一。目前Hp对克拉霉素等抗生素的耐药率逐渐升高〔2, 3〕,这给治疗Hp感染带来很大的困难。为了探讨携带CagA的Hp菌株与耐药性基因分型的关系,本研究选取胃黏膜Hp分离株,采用PCR方法扩增其CagA基因,采用E-test筛选对克拉霉素耐药的菌株,运用细菌基组重复性元件序列PCR技术(repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction,REPPCR) 对耐药菌株进行了基因分型和聚类分析。现将结果报告如下。

1 对象与方法 1.1 对象

收集2006年1月-2008年12月右江民族医学院附属医院胃镜室确诊的胃炎、消化性溃疡患者482例,采集其胃黏膜标本。

1.2 方法 1.2.1 主要仪器与试剂

电热恒温培养箱、电子天平(上海一恒科技公司);麦氏比浊仪(法国梅里埃公司);PCR仪、离心机、电泳仪、成像摄像系统(深圳市赛泰克生物科技有限公司);哥伦比亚培养基、微需氧塑料袋、产气袋、厌氧指示剂、 封口夹(广州迪景微生物科技有限公司);可疑菌株生化试验试剂(上海捷瑞生物工程有限公司);克拉霉素E-test纸条(瑞典AB Biodisk公司);DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司);引物(上海捷瑞生物工程有限公司);质控菌株J99、 ATCC43504(中国幽门螺杆菌菌株管理和保藏中心提供)。

1.2.2 菌株分离培养

把采集的胃窦部黏膜先利用Hp快速尿素酶实验进行筛选,阳性者则收集保存于脑心浸液培养基中,把培养基置保温瓶中冷冻送回实验室。在无菌工作台上把采集的胃黏膜和脑心浸液倒置在配制好的哥伦比亚血琼脂培养基中,使用手术剪刀快速把黏膜组织剪碎,然后使用L棒在哥伦比亚血琼脂培养基表面把黏膜碎粒涂布均匀,迅速放入厌氧塑料袋,剪开小型厌氧产气袋,放入厌氧指示剂,最后使用厌氧塑料袋封口夹封闭厌氧塑料袋,放置35℃培养7 d,对疑似菌株进行革兰染色、尿素酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验。证实为Hp有374株。

1.2.3 药物敏感性实验

用无菌棉拭子刮取数个经72 h传代纯培养的Hp菌落置于5 mL无菌生理盐水中,用麦氏比浊仪调整菌液浓度为1.0麦氏单位,在无菌台上用无菌棉拭子醮取已制备好的菌悬液均匀涂布于Hp培养基平板上放置 2~3 min,待平板表面凉干后用无菌镊子贴上克拉霉素E-test 纸条,微需氧环境35℃培养3~5 d。克拉霉素E-test药敏实验结果判断:读取MIC,敏感≤0.25,中介0.5,耐药≥1.0。采用ATCC43504为质控菌株(中国幽门螺杆菌菌株管理和保藏中心提供)。

1.2.4 HpDNA提取与CagA+基因扩增

采用DNA提取试剂盒提取HpDNA,按照使用说明出操作。(1)引物序列:CagA 1:5'-ATAATGCTAAA TAGACAACTTGAGCGA-3',CagA 2:5'- TTAGAATAATCAACA AACATCACGCCAT-3',CagA基因片段扩增长度为297 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计 CagA。(2) PCR扩增体系:20 μL,其中包括引物各0.5 μL,TaqDNA聚合酶2.0U,dNTP 0.4 mmol,MgCl22.0 mmol/L,模板5 μL;(3)热循环反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性 1 min,55℃退火1 min,35个循环;72℃延伸5 min;每次反应均设置空白对照。(4)电泳与观察:电压5v/cm,1%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,Syngene凝胶成像系统中观察结果并照相保存。

1.2.5 REP-PCR反应

(1)引物:Hp引物1:3'-CGGICTACIGCIGCIIII- 5',引物2:5'-ICGICITTATCIGGCCTAC-3'。 (2)细菌基因组重复性元件序列PCR技术的混合液制备: PCR反应体系25 μL,其中包括双蒸水14.25 μL,dNTP 0.5 μL,10 × PCR缓冲液2.5 μL,引物各0.5 μL,50 mmol/L的 MgCl2 为1.25 μL,2U TaqDNA聚合酶0.5 μL,模板5 μL。 (3)热循环反应条件:95℃预变性30 s,80℃ 2 min,94℃变性30 s,40℃退火1 min,65个循环;65℃延伸8 min,65℃ 末端延伸8 min。每次反应均设置空白对照。(4)琼脂糖凝胶电泳:取PCR反应产物10 μL在1%琼脂糖凝胶中(含EB 0.5 μg/mL)进行电泳,60 V、30 min,Marker是λDNA EcoRIHindⅢ (上海捷瑞生物工程有限公司),在成像系统下成像。

1.2.6 聚类分析

以REP-PCR扩增的基因图谱条带偏移做记录,有偏移者记为1,无偏移者记为0,应用NTsys_2软件进行聚类分析。

2 结 果 2.1 药物敏感性

胃粘膜标本482份中,分离并鉴定到Hp 感染阳性株374株,药物敏感性试验结果显示,Hp感染阳性株中,对克拉霉素耐药株为82株,耐药率21.93%。

2.2 CagA+基因阳性扩增产物(图 1)
注:M:100bp DNA ladder;1~5:Hp CagA基因扩增产物。 图 1 Hp CagA 基因扩增图谱

374株Hp阳性株中,CagA阳性87株,阳性率23.3%;扩增产物长度为297 bp。

2.3 Hp耐药株扩增产物(图 2)
注:M: DNA 标准带; 01～26: Hp 耐药株; ATCC43504:质控菌株。 图 2 26 株耐药性的CagA 阳性的Hp 菌株REP-PCR 指纹图

随机选择26个不同来源的对克拉霉素耐药的菌株进行REP-PCR扩增,结果可见,不同菌株具有不同的指纹图,与国外报道的Hp基因组多样性相符合。

2.4 聚类分析(图 3)
图 3 26 株CagA 阳性的Hp 耐药株相似性分析树状图

采用NTsys_2软件对26个耐药性菌株扩增指纹图谱进行相似性分析,根据相似性78%分类〔4〕,可以分成6类基因型。

3 讨 论 文献表明,REP-PCR广泛适用于多种细菌基因分型,可建立各种细菌的REP-PCR分型标准数据库〔5, 6〕。本研究采用REP-PCR技术对消化性溃疡和胃炎患者胃粘膜标本Hp分离株携带CagA基因的状况以及对克拉霉素耐药株进行了基因分型分析,结果显示,分离自不同患者的26株菌株具有不同的指纹图,与国外报道的Hp基因组多样性相符合〔7〕。相似性分析结果表明,按照相似性78%分类〔4〕,26株耐药性菌株可以分成6类基因型,与本课题组另文报道〔4〕随机抽取的其他26株耐药株(既有携带CagA基因的菌株也有不携带 CagA基因的菌株)基因分型结果基本一致,提示CagA基因与Hp的克拉霉素耐药性基因分型并无密切关联,其中的原因可能是幽门螺杆菌基因结构具有高度变异性,耐药性突变是由特定的耐药基因突变引起,耐药性分型与耐药基因有关,但是与不同位点的CagA基因无关。由于菌株数量较少,尚未进一步分析与其他基因相关性,有待深入探讨。

参考文献
〔1〕 邹全明,郭刚.人幽门螺杆菌基因组研究概述[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册,2002,23(2):65-66.
〔2〕 张丽萍,卢启明,张岫兰,等.甘肃省天祝县幽门螺杆菌感染状况分析[J].中国公共卫生,2008,24(8):1023-1024.
〔3〕 黄宏思,黄衍强,黄赞松,等.胃溃疡及胃炎患者幽门螺杆菌耐药性分析[J].中国公共卫生,2010,26(1):0059-0060.
〔4〕 黄衍强,黄宏思,黄赞松,等.桂西地区对克拉霉素耐药的幽门螺杆菌基因分型研究[J].中华医学检验杂志,2010,33(1):37-41.
〔5〕 徐顺福,赵志泉.幽门螺杆菌的分子生物学[J].国外医学:消化疾病分册,2000,20:134-138.
〔6〕 Sicinschi LA,Correa P,Schneider BG.Comparison of genotyping of Helicobacter pylori cagA and vacA virulence genes from gastric biopsies and stool specimens[J].Helicobacter,2003,8:601-607.
〔7〕 李倩,代敏,段广才,等.幽门螺杆菌16S rDNA指纹图和PCR-RFLP基因分型研究.中国人兽共患病杂志,2003,19(1):72-75.