金雀异黄素(genistein)是存在于植物中的天然异黄酮化合物,研究发现genistein对多种肿瘤细胞均有抑制作用^{〔1, 2, 3, 4〕}。 为了解genistein对胶质瘤细胞株U251MG生长和周期的影响,探讨其可能的机制,本实验观察了genistein对胶质瘤细胞株生长的影响,对U251MG细胞周期的影响,并检测了细胞周期素B1(cyclin B1)和细胞周期素依赖性蛋白激酶1 (CDK1)蛋白表达。结果报告如下。

(1)细胞株:U251MG细胞株(北京大学医学部)。(2) genistein:纯度不低于98%(美国Sigma公司)。(3) 仪器和试剂:胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) (美国Sigma公司);RPMI1640培养基(美国Gibco公司),新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、CDK1和β-肌动蛋白(β-Actin)兔多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);鼠二抗及发光剂(美国Cell Signaling Technology公司);聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(洛阳华美生物工程公司),BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司); Epics-XLⅡ流式细胞仪(美国Backman Coulter公司),酶标仪(郑州博赛生物工程公司)。

细胞在含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养、传代。genistein用0.1% DMSO溶解,用时配成所需浓度,实验与对照的DMSO溶剂浓度相同。

采用MTT法观察,取对数生长期U251MG细胞,接种于96孔培养板,每孔2 × 10³个细胞,培养24 h后,加入Genistein使其终浓度分别为 0(DMSO对照)、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL,每个浓度设5 个平行孔,分别培养24、48、72、96 h,加入5 mg/mL MTT 10 μL,再培养4 h后,吸尽板中培养液,各孔加100 μL DMSO,振动10 min后,用酶标仪(波长570 nm)测定各孔吸光度(A) 值,以每组5个孔的平均值作为各组平均A值。计算 genistein对U251MG细胞的抑制率,计算公式:抑制率=(1- 实验组A/对照组A)× 100%。

采用流式细胞仪检测,取对数生长期的U251MG细胞,以1 × 10⁶/瓶接种于 25 cm²培养瓶中,培养24 h,待细胞贴壁后,加入浓度分别为 0(DMSO对照)、25、50 μg/mL的genistein,每个浓度为3瓶,培养48 h后,0.25%胰酶消化细胞,1 000 r/min离心5 min收集细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,70%乙醇(4℃预冷)固定细胞,核糖核酸酶消化,加入碘化丙啶,铜网过滤上机检测细胞周期。

采用蛋白免疫印迹(western blotting)检测,取对数生长期的U251MG 细胞,以1 × 10⁶/瓶接种于25 cm²培养瓶中,培养24 h,待细胞贴壁后,加入浓度分别为0(DMSO对照)、25、50 μg/mL的 genistein,每个浓度为3瓶,培养48 h后,0.25%胰酶消化,收集细胞,PBS洗涤3次,转移到1.5 mL离心管中,加入100 μL 裂解缓冲液,冰浴振荡1 h,4℃ 12 000 r/min离心30 min,吸取上清液,测每一样品蛋白总量。样品经10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳后,将SDS聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上,4 ℃封闭过夜。取出PVDF膜,放入含一抗抗体的封闭液中,4 ℃过夜,含吐温-20的氨基丁三醇-盐酸缓冲液(Tween-TBS)洗3次,每次5 min,加入相应二抗,室温下2 h后用Tween-TBS洗3次,每次5 min。将膜放在1张保鲜膜上,化学发光法放射自显影术检测表达信号,图像分析系统对胶片泳带进行定量分析,以β-actin (42 KD)做内参照,cyclin B1、CDK1蛋白表达量用相对比率来表示。

采用SSPS 16.0软件进行分析,结果用x±s 表示,均数间比较采用方差分析。

图 1

图 1 不同浓度Genistein 对U251MG 细胞生长的影响

Genistein 作用24 h,浓度为6.25~25 μg/mL时,genistein对U251MG 细胞生长有不同程度促进作用;浓度在50~100 μg/mL时则呈抑制作用;作用48 h以后,各浓度genistein对U251MG细胞均呈抑制作用,同一时间点抑制率随浓度升高而明显升高,呈剂量依赖性,同一浓度抑制率随时间延长明显升高,呈时间依赖性。

表 1

表 1 Genistein 作用于U251MG 细胞48 h 对细胞周期的影响

表 1 Genistein 作用于U251MG 细胞48 h 对细胞周期的影响

DMSO对照组和genistein作用组G₀/G₁ 期、S期和G₂/M期细胞所占比例差异均有统计学意义(F=186.262,P < 0.01;F=79.13,P < 0.01;F=161.400,P < 0.01);Genistein作用组G₀/G₁ 期、S 期细胞所占比例均较DMSO对照组下降,高浓度组低于低浓度组;G₂/M期细胞所占比例较DMSO对照组明显增加,高浓度组高于低浓度组,表明genistein对U251MG细胞有明显的 G₂/M期阻滞效应。

图 2

注:a:DMSO对照组;b:25 μg/mL组;c:50 μg/mL组。 图 2 不同浓度genistein 作用48 h 后U251MG细胞cyclinB1 蛋白表达

图 3

注:a:DMSO对照组;b:25 μg/mL组;c:50 μg/mL组。 图 3 不同浓度genistein 作用48 h 后U251MG细胞cyclinB1 蛋白表达

表 2

表 2 Genistein 作用48 h 后cyclin B1、CDK1 蛋白表达

表 2 Genistein 作用48 h 后cyclin B1、CDK1 蛋白表达

cyclinB1和CDK1蛋白分子量分别为60和34 KD,DMSO对照组和genistein作用组在60和34 KD位置均出现阳性条带。 DMSO对照组和genistein作用组cyclin B1、CDK1的蛋白表达差异均有统计学意义(F=119.744,P < 0.01;F=75.933,P < 0.01);Genistein作用组cyclin B1、CDK1蛋白表达均较对照组明显下降,高浓度组低于低浓度组。

本研究结果显示,当genistein达到一定浓度或(和)一定时间后,对U251MG细胞生长有明显的抑制作用,且呈时间剂量依赖性。流式细胞仪分析细胞周期显示,genistein在降低 G₀/G₁ 期和S期细胞比例的同时,显著增加G₂/M期细胞数量,可见genistein可使U251MG细胞阻滞于G₂/M期,使之无法完成有丝分裂,从而抑制其增殖活性。由此表明genistein 使U251MG细胞发生G₂/M期阻滞是抑制胶质瘤细胞生长的机制之一。

细胞周期得以运行的核心机制是在一系列细胞周期素时相性起伏的调控下,相应的细胞周期素依赖性蛋白激酶 (CDKs)依次激活,驱动细胞通过G₁、S、G₂、M期,完成细胞的增殖过程。CDK1的激活是细胞由G₂ 期进入M期的关键,CDK1的激活一方面需要cyclin B1和CDK1蛋白一定的表达量,另一方面还需要cyclin B1与CDK1结合形成复合物以及 CDK1的去磷酸化状态^〔5〕。研究表明,genistein在诱导肿瘤细胞G₂/M期阻滞的同时,伴有cyclin B1和CDK1的表达下降^{〔4, 6〕}。本实验结果显示,genistein可下调U251MG细胞cyclin B1和CDK1的蛋白表达量,从而影响了CDK1的活化,导致了G₂/M期阻滞。

综上所述,genistein可通过诱导G₂/M期阻滞抑制 U251MG细胞生长,诱导G₂/M期阻滞与下调cyclin B1和 CDK1蛋白表达有关。