维生素A缺乏和铁缺乏是主要的营养缺乏性疾病,影响全球超过数十亿人群健康。维生素A和铁代谢存在一定联系,维生素A的水平对铁稳态调节有明显影响,维生素A缺乏是导致贫血发生的病因之一,但是维生素A导致贫血发生机制还不十分清楚^〔1〕。正常情况下,铁稳态是在多种细胞蛋白调控下保持平衡的,既保证细胞、组织对铁的利用,同时防止铁超载发生,这些蛋白包括参与细胞铁摄取的转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)和参与铁贮存的铁蛋白(ferrintin,Fn),而铁调节蛋白(iron regulatory proteins,IRP)是监测铁水平并在转录后水平对这2种蛋白起到核心调节作用的一种细胞溶质蛋白^〔2〕。由于IRP在铁稳态中起非常关键作用,因此,本研究旨在通过了解维生素A缺乏对IRP影响,探索维生素A缺乏导致贫血发生的机制。

血红蛋白、氰化高铁血红蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所),血清铁蛋白、血清转铁蛋白受体 ELISA试剂盒(美国Adlitteram Diagnostic Laboratories公司); AA7000火焰原子吸收仪(北京东西电子公司);TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

清洁级雄性SD大鼠(北京维通利华公司),许可证号:SCXK (京)2006-0009,48只,21日龄,适应 1周后,按体重随机分为4组,每组12只。按生长期啮齿类动物纯化饲料配方(AIN-93),调整其中维生素A和铁含量,对照组(Fe:45 mg/kg,维生素A:1 200μg/kg),维生素A完全缺乏组(Fe:45 mg/kg,维生素A:0μg/kg),维生素A边缘缺乏组(Fe:45 mg/kg,维生素A:120μg/kg),铁及维生素A边缘缺乏组(Fe:15 mg/kg,维生素A:120μg/kg)。大鼠单笼饲养,自由进食及饮用蒸馏水,每周称重1次,并记录摄食量。喂养8 周后,麻醉处死大鼠,腹主动脉取血,分离血清,取肝脏,脾脏和股骨,称重后用液氮速冻,-80℃保存待测。

采用RT-PCR法,提取肝脏总RNA;β-actin (512 bp)上游引物:5'-GTG ATG GTG GGA ATG GGT CAG-3',下游引物:5'-TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3'。TfR (708 bp)上游引物:5'-ACA TGG ACA GGA ATA CGT TC-3',下游引物:5'-CAA TCG GAT GCT TTA CGT CC-3'。Fn (250 bp)上游引物:5`-GTC TCC CTC GCA AGT GCG CC-3`,下游引物:5`-TGC ATT CAG CCC GCT CTC CC-3`。IRP2(459 bp)上游引物:5'-GTT TGT CTC CAG GCA GTG-3',下游引物5'-ACC GTT TAT TTC CCA TCT-3'。引物序列由上海英俊生物技术有限公司合成。PCR条件为94℃ 预变性4 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸50 s,TfR、β-actin 35个循环,TfR、Fn 30个循环。72℃ 10 min后,4 ℃储存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果在凝胶图象分析系统上扫描,计算IRP2、TfR、Fn mRNA产物密度与 β-actin密度比值。

实验数据采用SPSS13.0进行统计分析。组间比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK-Q检验,以 P < 0.05为差异具有统计学意义。

在实验期间各组间大鼠初始体重、终末体重和体重增长差异均无统计学意义(P > 0.05)。动物生长状况良好。在实验期末,各维生素A缺乏组出现了不同程度维生素A缺乏症状,如皮毛干枯,失去光泽,脱毛等,动物还出现性情暴躁,易激惹的情况。

表 1

表 1 各组动物肝脏、脾脏、股骨铁含量(μmol /g，x±s，n = 12)

表 1 各组动物肝脏、脾脏、股骨铁含量(μmol /g，x±s，n = 12)

各组动物肝脏湿重、脾脏湿重和股骨湿重无明显差异(P > 0.05)。与对照组比较,维生素A缺乏组大鼠肝脏铁含量无明显变化 (P > 0.05),但随着维生素A缺乏加剧肝脏中铁含量有增加趋势。与对照组比较,维生素A完全缺乏组大鼠脾脏铁含量明显增加(t=3.28,P=0.00),维生素A边缘缺乏组、铁及维生素A边缘缺乏组大鼠脾脏铁水平明显低于维生素A完全缺乏组(t=2.66、3.72,P < 0.05)。

表 2

表 2 各组动物血清维生素A、血红蛋白、血清铁、Fn、TfR 含量变化(x±s，n = 12)

表 2 各组动物血清维生素A、血红蛋白、血清铁、Fn、TfR 含量变化(x±s，n = 12)

各维生素A缺乏组大鼠血清维生素A含量明显低于对照组 (F=23.46,P=0.00),与维生素A边缘缺乏组比较,维生素 A完全缺乏组血清维生素A含量更低(t=3.21,P=0.00)。 各组大鼠血红蛋白浓度无明显差异(P > 0.05)。与对照组比较,维生素A缺乏组动物血清铁均有明显下降(F=4.83,P < 0.05),约降低56%。与对照组比较,各维生素A缺乏组大鼠血清铁蛋白浓度明显降低(F=9.82,P=0.00),维生素A边缘缺乏与完全缺乏组大鼠血清转铁蛋白受体浓度明显升高 (t=2.23、2.54,P=0.00)。

与对照组比较,各维生素A缺乏组大鼠Fn mRNA表达量明显下降(F= 65.36,P=0.00),各维生素A缺乏组之间Fn mRNA表达水平无明显差别。各维生素A缺乏组大鼠TfR、IRP2 mRNA表达水平明显高于对照组(F=23.98、46.76,P=0.00)。

维生素A与铁之间存在着极其密切关系,可相互调控其正常生理功能和代谢^〔3〕,但它们之间的相互作用机制尚不清楚。本研究结果表明,维生素A缺乏组大鼠维生素A和铁水平出现了不同程度降低,并且各维生素A缺乏组大鼠血清维生素A浓度均< 0.7 μmol/L,表明维生素A缺乏动物模型构建成功。IRPs作为在转录后水平监测细胞铁水平、调节IRP 与铁反应元件(iron responsive element,IRE)结合活性调节铁代谢相关蛋白表达的关键蛋白,可保证需铁组织对铁的利用,同时防止铁中毒的发生^〔4〕。本研究结果表明,维生素A缺乏使IRP2 mRNA表达水平增加,在转录后水平通过IRP2调节增加TfR mRNA表达,同时使Fn mRNA表达量减少。其调节结果使肝细胞铁贮存减少,而铁摄取增加。使肝细胞从血中摄取、吸收铁增加,使机体肝、脾等网状内皮细胞系统铁含量增加,骨髓铁摄取受损和红细胞内铁含量降低,最终加剧贫血进程^〔5〕。在对大鼠原代细胞的研究中发现,IRP2 mRNA水平会随着加入全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,atRA)的浓度增加而呈现降低趋势^〔6〕。Stacy等^〔7〕研究也证实atRA可以作为降低IRP-RNA结合能力的信号从而改变参与铁代谢调节的关键蛋白表达。

维生素A缺乏很有可能通过影响对细胞内铁稳态起到监测和调节关键作用的IRPs功能,继而影响TfR和Fn,并通过该途径导致贫血的发生。