中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (10): 1263-1266   PDF    
引用本文
黄铖铖, 孙秀锦, 胡明江, 程跃进, 古桂雄, 崔凤梅. 60Coγ射线诱发小鼠DNA甲基化改变[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(10): 1263-1266.
HUANG Cheng-cheng, SUN Xiu-jin, HU Ming-jiang, et al. DNA methylation changes induced by 60Co γ-ray irradiation[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(10): 1263-1266.
60Coγ射线诱发小鼠DNA甲基化改变
黄铖铖1, 孙秀锦2, 胡明江2, 程跃进2, 古桂雄1 , 崔凤梅2     
1. 苏州大学附属儿童医院, 江苏苏州215003;
2. 苏州大学医学部放射医学与公共卫生学院
收稿日期: 2010-08-26.
基金项目: 国家自然科学基金(30800922);江苏省高校自然科学基础研究面上项目(08KJD310007)
作者简介: 黄铖铖(1985- ),女,安徽池州人,硕士在读,研究方向:电离辐射与生长发育。
通讯作者: 崔凤梅,E-mail:cuifengmei@suda.edu.cn;古桂雄,E-mail:szggx000@163.Com
摘要: 目的 探讨基因组启动子甲基化谱及DNA甲基化酶1(DNMT1)表达量在60Co-γ射线照射小鼠各组织的变化及其意义。方法 SPF级C57BL/6J雄性小鼠12只随机分为对照组和照射组,照射组小鼠接受4Gy60Co-γ射线单次全身照射后,均眼球摘除取血后处死,收集各脏器组织,进行外周血白细胞计数和骨髓嗜多染红细胞微核计数,应用甲基化DNA免疫沉淀-芯片(MeDIP-chip)杂交技术对γ射线照射小鼠肝组织基因组启动子(promoter)CpG岛甲基化改变进行分析,并采用免疫组化(SP)法和蛋白质印记(western blot)法检测小鼠各组织DNMT1的表达情况。结果 与对照组比较,照射组小鼠基因组启动子甲基化谱发生了明显改变,照射组1 300个基因的启动子CpG岛发生了新的甲基化,660个基因发生去甲基化;提高筛选标准,最后可得到发生明显甲基化的基因有Trim71、Sema3f、Pcdh8、Sox4、1110034A24Rik、Limk1、Nefl、Xpr1,明显去甲基化的基因有Sfrs18、Dr1、Ankrd42、Nae1、Sfi1、Accn1、Srd5a1、Nsun2、Eif1a、Dusp5;照射组小鼠除肺组织外肝脏、肾、睾丸及脑组织的DNMT1表达量均高于对照组(P<0.05)。结论 在电离辐射损伤中基因组启动子甲基化模式发生了改变,DNMT1表达增加可能是导致启动子发生甲基化的原因。
关键词: 60Co-γ射线     DNA甲基化     甲基化DNA免疫沉淀-芯片     DNA甲基化酶    
DNA methylation changes induced by 60Co γ-ray irradiation
HUANG Cheng-cheng, SUN Xiu-jin, HU Ming-jiang, et al    
Affiliated Children’s Hospital of Soochow University, Suzhou 215003, China
Abstract: Objective To study the change and significance of DNA methylation pattern and DNA methyltransferase (DNMT1)protein in 60Co γ-ray irradiated mice tissues.Methods Twelve SPF C57BL/6J mice were randomly divided intocontrol group and radiation group.The radiation group were exposed to 4Gy-single whole body radiation.All mice were sacrificed 3 days after the radiation.The total number of peripheral white blood cells and the frequencies of micronucleated polychromatic erythocytes(fMNPCE)were measured.Methylated DNA immunoprecipitation-chip(MeDIP-chip)was adopted to investigate the differentially expressed CpG islands methylation profiles in mouse liver genome promoter.The immunohistochemical(SP method)and western blot method were used to check the expression of DNMT1 protein in tissues.Results Compared with the control group,the promoter methylation profiles of irradiated mice changed obviously,with 1300 genes methylated and 660 genes demethylated.With the improvement of the screening criteria,the obviously methylated genes were Trim71,Sema3f,Pcdh8,Sox4,1110034A24Rik,Limk1,Nefl,and Xpr1 and the demethylated genes were Sfrs18,Dr1, Ankrd42,Nae1,Sfi1,Accn1,Srd5a1,Nsun2,Eif1a,and Dusp5.Except in the lung,the expression of DNMT1 protein in liver, kidney,testicle,and brain tissues were all increased(P < 0.05).Conclusion There are methylation changes of gene promoter in ionizing radiation injury and the increased expression of DNMT1 may be the reason of gene promoter methylation.
Key words: 60Coγ-ray irradiation     DNA methylation     MeDIP-chip     DNMT1    

DNA甲基化在高等真核生物的发育分化、基因表达模式的时空调控以及基因组的稳定性中均起着十分关键的作用。 环境因素可引起机体细胞内DNA甲基化模式的改变,DNA 甲基化酶(DNA methyltrasferases,DNMTs)在其中扮演着关键角色,它们的功能变化在机体发育和疾病发生发展中起着重要作用〔1〕。许多研究证实,电离辐射可以诱导DNA甲基化模式发生改变〔2〕。本研究采用甲基化DNA免疫沉淀-芯片(methylated DNA immunoprecipitation-chip,MeDIP-chip)杂交技术对60 Co-γ射线照射小鼠肝组织基因组启动子CpG岛甲基化模式进行分析,应用免疫组化-链霉菌抗生物素蛋白 -过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP)和蛋白质印记(western blot)法分析小鼠各组织DNMT1蛋白的表达情况,探讨DNA甲基化在电离辐射损伤中的改变。

1 材料与方法 1.1 实验动物及照射

实验用SPF级C57BL/6J小鼠12只,雄性,体重(20 ± 2) g,(苏州大学实验动物中心),随机分成照射组和对照组,每组6只,照射组小鼠接受60 Coγ射线单次全身照射(4Gy,1Gy/min)。照射后第3 d各组小鼠均眼球摘除取血后处死,收集各脏器组织。

1.2 外周血白细胞计数和骨髓嗜多染红细胞微核计数

抗凝血经白细胞稀释液稀释后,滴在计数板上,静置3 min,在低倍镜下计数四角4个大方格的白细胞总数。白细胞总数 (/L)=4格总数× 5 × 107。取2根股骨,用2mL小牛血清冲洗骨髓腔,收集至离心管中,离心后弃上清液,按血常规涂片法涂片,每鼠制备3张涂片,甲醇固定后染色。先以低倍镜、 高倍镜粗检,选择细胞分散均匀,细胞无损,染色良好的区域,转到油镜下进行计数。每只动物计数10 000个嗜多染红细胞,微核率以千分率表示。

1.3 甲基化谱检测 1.3.1 主要材料、试剂和仪器

DNA提取试剂盒(德国Qiagen 公司),BiomagTM磁珠(美国Bangs laboratories.公司),5-甲基胞嘧啶抗体(小鼠)(1μg/μL)(比利时Diagenode公司),小鼠IgG (1 μg/μL)(美国Jackson公司),QIAquick纯化试剂盒(德国Qiagen公司),Cy3/Cy5荧光标记引物(美国Tri- Link Biotechnologies公司),杂交试剂盒40,NimbleChip X1混合试剂盒,杂交系统(美国NimbleGen公司),GenePix 4000B (美国Axon公司)。

1.3.2 MeDIP-chip组织DNA提取

具体操作按照试剂盒所附说明书进行。采用鼠源型5-甲基胞嘧啶一抗和二抗标记的BiomagTM磁珠免疫沉淀DNA。采用酚-氯仿萃取法和乙醇沉淀法提取和纯化免疫沉淀DNA,分别用Cy3、Cy5荧光标记引物标记输入DNA和免疫沉淀DNA,杂交形成NimbleGen MM8 CpG Promoter芯片,采用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转为数字型数据保存(EXCEL 格式),GenePix pro V6.0对原始数据进行分析运算。

1.4 各组织DNMT1含量检测 1.4.1 主要试剂

抗DNMT1多克隆抗体和RIPA蛋白裂解液(美国Cell Signaling Technology公司),通用型二抗购自联科生物技术公司,增强化学发光试剂盒(美国Biological Industries 公司)。

1.4.2 免疫组化分析

各脏器的DNMT1采用免疫组织化学 SP法检测,具体操作按照试剂盒所附说明书进行。用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)替代一抗作阴性对照。结果判定:免疫组化染色阳性反应为以细胞核出现棕褐色颗粒为阳性。光镜下每个样本取20个有代表性的高倍视野(× 400)进行细胞计数,共计数3 000个细胞,计算染色阳性细胞在同类细胞中所占百分率(%)。以阳性细胞百分率 ≥15%为表达阳性,< 15%为表达阴性。

1.4.3 Western blot分析

收集各脏器组织蛋白样品,经 Brad-ford法测定样品浓度后各取20μg总蛋白电泳,转膜后以5%脱脂奶粉进行非特异性抗原的封闭,DNMT1 4℃孵育过夜,洗膜后以辣根过氧化物酶(horizontag radiation pottern,HRP)偶联的二抗溶液室温孵育1 h,洗膜后采用显色试剂盒室温反应1 min,于暗室内对X线感光胶片进行曝光,经显影、定影,最后对所得结果进行分析。

1.5 统计分析

采用SPSS 12.0统计软件进行分析,微核采用泊松分布进行统计,方差分析比较组间差异。DNMT1表达差异采用χ2检验进行统计。

2 结 果 2.1 外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率(表 1)
表 1 γ 射线照射后小鼠外周白细胞数和骨髓嗜 多染红细胞微核率

2组小鼠骨髓涂片上均可观察到嗜多染红细胞及微核,嗜多染红细胞呈灰蓝色,微核呈紫红色或蓝紫色,大多数呈圆形或椭圆形,单个嗜多染红细胞中可观察到1个或2个甚至3个微核,但大多数单个存在。

2.2 NimbleGen MM8 CpG Promoter芯片结果(表 2、3)
表 2 照射组启动子出现甲基化基因

表 3 照射组启动子区发生去甲基化基因

与对照组比较,照射组小鼠肝组织基因组启动子甲基化谱发生了明显改变:对照组3 922个基因的promoter区CpG岛存在甲基化现象,而照射组为4 560个基因。其中照射组1 300个基因的启动子CpG岛发生了新的甲基化,发生去甲基化的基因为660个,每条染色体的甲基化谱均发生改变,其中发生甲基化最多的为chr11(134个基因),发生去甲基化最多的为 chr2(67个基因),发生改变最小的染色体为chrY (2个基因)。提高筛选标准,最后可得到发生明显甲基化的基因有 Trim71、Sema3f、Pcdh8、Sox4、1110034A24Rik、Limk1、Nefl、 Xpr1,明显去甲基化的基因有Sfrs18、Dr1、Ankrd42、Nae1、 Sfi1、Accn1、Srd5a1、Nsun2、Eif1a、Dusp5。

2.3 DNMT1含量 2.3.1 免疫组化结果(表 4,图 1-8)
表 4 DNMT1 在各脏器组织表达

图 1 对照组－肝组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

图 2 照射组－肝组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

图 3 对照组－肾组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

图 4 图4 照射组－肾组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

图 5 对照组－肺组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

图 6 图6 照射组－肺组织DNMT1 的表达(SP 法× 400 )

图 7 对照组－睾丸组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

图 8 照射组－睾丸组织DNMT1 的表达(SP 法× 400)

结果可见,γ射线照射后,除肺组织外,小鼠肝脏、肾和睾丸组织的DNMT1表达量与对照组比较均增加,且差异有统计学意义(P < 0.05)。

2.3.2 Western blot印记法检测相关蛋白的表达(图 9、10)
图 9 小鼠睾丸组织DNMT1 蛋白表达水平

图 10 小鼠脑组织DNMT1 蛋白表达水平

Western blot印记法检测表明,4Gy60 Co-γ射线照射小鼠 48 h后,睾丸和脑组织DNMT1的表达升高。

3 讨 论

近年来,对电离辐射诱导的DNA甲基化模式改变的研究主要集中在DNA甲基化水平的研究,而电离辐射对特定基因的启子区CpG岛的DNA甲基化状态影响报道较少〔2〕。本实验表明,可能相关基因的启动子甲基化和去甲基化与γ射线引起的白细胞数和微核率改变相关。发生明显甲基化和去甲基化的基因中,基因功能涉及到蛋白质的翻译(Eif1a)、转录 (Sox4、Dr1)、转录调控(Sox4、Dr1),信号转导(Pcdh8、 Limk1、Nae1、Srd5a1),细胞骨架形成(Limk1、Nefl),发育(Sema3f 、Limk1、Accn1)特别是神经系统发育等诸多方面,参与了 γ射线诱发的辐射损伤。

DNMT1,主要与复制后形成的半甲基化发生反应,可获得与亲本完全相同的甲基化形式,从而形成了表观遗传学信息在细胞和个体世代间传递的机制〔3〕。已有研究表明发生甲基化的原因是由于CpG岛保护因子缺失、DNA甲基化转移酶(DNMT)过度表达、DNMT结合因子功能失调以及基因组各部分复制时时空紊乱等因素造成的〔4〕。已有研究表明,电离辐射影响DNMT1的表达 〔2, 5, 6〕。本实验免疫组化和western blot结果显示,照射组小鼠除肺组织外,肝、肾、睾丸、脑组织DNMT1均表达上调。Kalinich等〔5〕发现,电离辐射可以导致细胞核内DNMT活性下降而同时细胞质中DNMT升高,并提出可能是电离辐射影响了核膜的包被能力或核孔复合体的功能,从而使核内的DNMT"漏"到了细胞质内,或者细胞质内新合成的DNMT进入核内异常。但是该假设尚无学者进一步验证。有学者通过建立辐射旁效应小鼠模型探讨DNA 损伤和修复与表观遗传学的关系时发现,直接照射小鼠皮肤的DNMT1表达未发生明显变化,而在旁效应组织DNMT1的表达明显增加〔7〕。电离辐射影响DNMT1的表达,而其表达量的改变可能是一动态过程,由于各实验采用照射剂量、照射方法和时间点等因素不同,导致实验结果不同,进一步表明电离辐射诱导的DNA甲基化改变是一复杂的分子生物反应过程,涉及到DNMT1表达等诸多尚未阐明的机制。

参考文献
〔1〕 王志刚,吴建新.DNA甲基转移酶分类、功能及其研究进展[J].遗传,2009,31(9):903-991.
〔2〕 石大伟,赵永成.电离辐射诱导的DNA甲基化模式改变及其在辐射致癌机制研究中的意义[J].国际放射医学核医学杂志,2006,30(4):240-243.
〔3〕 Kurita S,Higuchi H,Saito Y,et al.DNMT1 and DNMT3b silencing sensitizes human hepatoma cells to TRAIL-mediated apoptosis via up-regulation of TRAIL-R2/DR5 and caspase-8[J].Cancer Sci,2010(101):1431-1439.
〔4〕 Tellez CS,Shen L,Estecio MR,et al.CpG island methylation profiling in human melanoma cell lines[J].Melanoma Res,2009,19(3):146-55.
〔5〕 Kalinich JF,Catravas GN,Snyder SL.The effect of gamma radiation on DNA methylation[J].Radiat Res,1989,117(21):185-197.
〔6〕 Pogribny I,Koturbash I,Tryndyak V,et al.Fractionated low-dose radiation exposure leads to accumulation of DNA damage and profound alterations in DNA and histone methylation in the murine thymus[J].Mol Cancer Res,2005,3(10):553-561.
〔7〕 Koturbash I,Rugo RE,Hendricks CA,et al.Irradiation induces DNA damage and modulates epigenetic effectors in distant bystander tissue in vivo[J].Oncogene,2006,25(31):4267-4275.