中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (10): 1237-1239   PDF    
引用本文
张锦海, 陈文琦, 朱进, 吕恒, 顾海涛, 王平, 鲁娟东, 王长军. 烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(10): 1237-1239.
ZHANG Jin-hai, CHEN Wen-qi, Zhu Jin, et al. Development of multiplex real-time PCR for detection of Bacillus anthracis, Yersinia pestis and Legionella pneumophila[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(10): 1237-1239.
烈性呼吸道细菌多重荧光PCR检测方法建立
张锦海1, 陈文琦2, 朱进1, 吕恒1, 顾海涛1, 王平1, 鲁娟东1, 王长军1     
1. 南京军区疾病预防控制中心, 江苏南京210002;
2. 南京医科大学附属南京第一医院
收稿日期: 2011-02-23.
基金项目: 国家“十一五”科技重大专项(2009ZX10004-315);国家重大传染病专项课题(2008ZX10004-008);江苏省科技支撑计划(社会发展)项目(BE2009621);南京军区重点课题(10Z038);南京军区面上课题(08MB149)
作者简介: 张锦海(1978- ),男,江西定南人,助理研究员,硕士,研究方向:病原生物学。
通讯作者: 王长军,E-mail:science2008@yahoo.com.cn
摘要: 目的 建立多重实时荧光PCR检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的方法。方法 设计分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌毒力因子基因和特异性结构基因的引物和荧光双标记探针,优化反应体系,建立2套均可同时检测3种细菌的多重实时荧光PCR方法,以及3种分别针对上述单一细菌的二重实时荧光定量PCR方法。结果 构建的多重和二重实时荧光PCR方法,检测敏感性分别达到100模板拷贝每反应和20模板拷贝每反应,并且高浓度模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显,对阳性菌株均100%检出,对常见杆菌检测均为阴性。结论 多重实时荧光定量PCR具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强、灵敏度好等优点,在炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的病原体检测方面有较大应用价值。
关键词: 多重实时荧光PCR     炭疽杆菌     鼠疫耶尔森菌     嗜肺军团菌    
Development of multiplex real-time PCR for detection of Bacillus anthracis, Yersinia pestis and Legionella pneumophila
ZHANG Jin-hai, CHEN Wen-qi, Zhu Jin, et al    
Center for Disease Control and Prevention of Nanjing Command, the People’s Liberation Army, Nanjing 210002, China
Abstract: Objective To develop a mutiplex real-time PCR for the detection of specific structural genes and virulence genes of Bacillus anthracis,Yersinia pestis,and Legionella pneumophila.Methods Six pairs of specific primers and six fluorogen-labled probes were designed and synthesized according to capA and PA genes of Bacillus anthracis,pla and caf1 genes of Yersinia pestis,and pilE and Mip genes of Legionella pneumophila.The reaction parameters such as the concentration of primers,probes and the reaction buffer were optimized to develop two sets of multiplex real-time PCR assay for rapid detection of Bacillus anthracis,Yersinia pestis,and Legionella pneumophila simultaneously.By using the same method,the duplex real-time PCR for the detection of Bacillus anthracis,Yersinia pestis,and Legionella pneumophila were also estimated.Results The detectable concentration for the multiplex real-time PCR and duplex real-time PCR was 100 template copy per reaction and 20 template copy per reaction,respectively,and the detection had good specificity,stability,and reproducibility.Conclusion The multiplex real-time fluorescence quantitative PCR assay developed in the study has good specificity and sensitivity and could to be applied for the detection of Bacillus anthracis,Yersinia pestis,and Legionella pneumophila.
Key words: multiplex real-time quantitative PCR     Bacillus anthracis     Yersinia pestis     Legionella pneumophila    

炭疽杆菌引起的炭疽病,尤其是肺炭疽,严重威胁公众财产、健康和生命安全〔1〕。鼠疫耶尔森菌可引起烈性传染病肺鼠疫,疾病传播快,历史上发生过多次毁灭性的流行〔2, 3〕。嗜肺军团菌引起的军团菌病,流行致死率高,全国已有多起散发与暴发流行的报道〔4, 5〕。这3种细菌均可通过空气飞沫经呼吸道传播,可形成气溶胶,易引发突发公共卫生事件,也常常被视为理想的生物恐怖/生物战病原〔6, 7, 8, 9〕。上述细菌的感染和危害,均由多种关键毒力因子共同作用所造成,如缺失其一,即为弱毒株甚至无毒株。本研究旨在针对细菌性烈性呼吸道传染病,建立一种多重检测方法及针对单一细菌的二重检测方法,结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)菌株和质粒:炭疽杆菌强毒株、鼠疫耶尔森菌(军事医学科学院五所微检中心);炭疽杆菌弱毒株、嗜肺军团菌(本室保存);大肠埃希菌XL10-Gold株(美国Stratagene 公司);线性化质粒载体pGEM-T easy (美国Promega公司)。(2)主要试剂:细菌DNA提取试剂盒、Pyrobest Taq DNA 聚合酶、DNA连接酶、DNAMarker DL2000、DNA纯化及片段回收、抽提质粒试剂盒、RNase H酶Tli RNase H II、Taq DNA聚合酶Ex Taq HS等(大连TaKaRa公司)。(3)主要设备:ABI 7500 Fast型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 方法 1.2.1 引物、探针的设计和合成

利用美国国立生物技术信息中心的GenBank数据库进行生物信息学分析,获得炭疽杆菌PX01质粒的保护性抗原(protective antigen,PA)基因、炭疽杆菌PX02质粒的荚膜合成相关基因A (capsule biosynthesis gene A,capA)序列;鼠疫耶尔森菌的纤溶酶原激活因子(plas-minogen activators,pla)基因、F1荚膜抗原(F1 capsule antigen,caf1)基因序列;嗜肺军团菌的Ⅳ型菌毛蛋白(type IV pilus assembly protein,pilE)基因、巨噬细胞感染增强因子(macrophage infectivity potentiator,mip)基因序列。使用Beacon Designer 等多种生物学软件,结合经验判断和人工比对、修正,分别对上述基因序列进行比较分析,设计引物和探针序列如下:(1) capA:引物5'-TGACGGATTATGGTGCTAAGG-3'和5'- AGTGCGTATTTACTACGACAAGA-3',探针(5'-3') FAM-GTGCTGGTGAA- Eclipse;(2) PA:引物5'-TACAGGCTCGAACTGGAGTG- 3'和5'-GCTATCCGCCTTTCTACCAG-3',探针(5'-3') TAMRA-CAACTGCACG-Eclipse;(3) Pla:引物5'-GTCGCTATCCTGAAAGGTGA- 3'和5'-CATTGGCATGATTAACATTTG- 3',探针(5'-3') JOE-TGAGTGGACAGA-Eclipse;(4) caf1:引物 5'-CAGCCCGCATCACTCTTACA-3'和5'-GGTTCTCACCGTT- TACCTTAG-3',探针(5'-3') FAM-TAGCACATCTG-Eclipse; (5) Mip:引物5'-GGTTTAACACCATTTCCAGCA-3'和5'-ACCGAACAGCAAATGAAAGAC- 3',探针(5'-3') TAMRAACAAGCCAGG- Eclipse;(6) pilE:引物5'-TGGTTTCAATTGCCTATCCA- 3'和5'-GATCTTGTGTCAATGTGGCAT-3',探针(5'- 3') JOE-CGTCGTGCCGA-Eclipse。探针为RNA和DNA构成的杂合探针,序列中带下划线的碱基是RNA碱基,5 '端分别标记6-carboxyfluorescein (FAM)、2,7-dimethoxy-4,5-dichloro- 6-carboxyfluorescein (JOE)、tetramethylrhodamine (TAMRA) 荧光基团,3'端标记Eclipse淬灭基团。委托Takara (大连)公司合成。

1.2.2 细菌DNA提取及质粒标准品的制备

按细菌DNA 抽提试剂盒说明书操作,从灭活的炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌中提取基因组DNA。按上述设计的引物对序列分别对相应细菌的基因组DNA进行PCR扩增,获得对应的各目标基因扩增产物(依次为capA基因片段、PA基因片段、 Pla基因片段、caf1基因片段、Mip基因片段、pilE基因片段); 用常规分子克隆方法〔10〕,将各扩增产物分别克隆至PGEM-T easy载体,宿主菌为XL10-Gold。用PCR鉴定和双向测序验证无误的质粒DNA,即为各目标基因的质粒标准品,紫外分光光度计定量后利用阿伏加德罗常数公式(6.02 × 1023)× (ng/μL × 10-9)/(DNA length × 660)=copies/μL计算浓度,根据需要稀释分装,置-20℃备用。

1.2.3 三重实时荧光定量PCR反应体系分组

采用相同反应条件下的2个25μL的三重实时荧光定量PCR反应体系: 第一反应体系针对炭疽杆菌的capA基因、鼠疫耶尔森菌的 Pla基因、及嗜肺军团菌的Mip基因;第二反应体系针对炭疽杆菌的PA基因、鼠疫耶尔森菌的caf1基因、及嗜肺军团菌的 pilE基因。第一、第二反应体系均选取与各个基因相对应的引物对、探针,各由3组引物对和3个探针构成。

1.2.4 二重实时荧光定量PCR反应体系分组

分别针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的3个二重实时荧光定量反应,均为25 μL反应体系。选取的引物对和探针分别由2 组引物对和2个探针构成:1组capA引物对和1个capA探针及1组PA引物对和1个PA探针;或者1组pla引物对和1 个pla探针及1组caf1引物对和1个caf1探针;或者1组mip 引物对和1个mip探针及1组pilE引物对和1个pilE探针。

1.2.5 实时荧光定量PCR反应体系

上述二重或三重实时荧光定量PCR的25μL反应体系,由以下组分构成:三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)混合溶液(各2.5mmol/L)3μL,MgCl2 溶液(25mmol/L)5μL,Tli RNase HⅡ(200 U/μL)0.5 μL,Ex Taq HS (5 U/μL)0.25μL,10 × Cycleave PCR Buffer 2.5μL,所需引物对工作液 (10μmol/L)各1μL,所需探针工作液(5μmol/L)各1μL,质粒标准品各1μL或样本待测液4μL,双蒸水补足至25μL。

1.2.6 实时荧光定量PCR反应参数

第1阶段:初期变性,95℃ 10s;第2阶段:PCR反应,为95℃变性5s,55℃退火10s,然后72℃ 25s延伸,并在此步骤监测荧光曲线;重复50个循环(循环数增多是为了更好的观察多重实时荧光扩增曲线的形状)。判断阳性的标准是:循环阈值(CT值)在35个循环内且扩增曲线呈S型。

1.2.7 多重实时荧光PCR的敏感性试验

将各目标基因质粒标准品的拷贝数作倍比连续稀释,浓度分别从101 copies/μL 至108 copies/μL,然后分别加入反应体系内进行单重、二重和多重荧光PCR扩增,测定单检和二检、三检的灵敏度。

1.2.8 多重实时荧光PCR的干扰性和特异性试验

将炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌标准样品不同的模板浓度进行组合(模板浓度最高相差105),进行三重实时荧光PCR检测,确定浓度相差较大时各细菌之间的检测是否存在相互干扰现象。再用优化后的多重实时荧光PCR检测方法对课题组保存的炭疽杆菌缺陷株、鼠疫杆菌核酸、嗜肺军团菌,以及11株各型沙门菌、9株志贺菌、6株枯草芽孢杆菌、5株产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)和5株普通大肠埃希菌、3株枸橼酸杆菌、2株铜绿假单胞菌进行检测。

2 结 果 2.1 第一反应体系检测结果(图 1)
注:1:FAM荧光通道(检测capA基因);2:TAMRA荧光通道(检测Mip基因);3:JOE荧光通道(检测Pla基因)。 图 1 三重实时荧光定量PCR 反应体系1 荧光曲线图
对组合的目标靶基因质粒标准品进行多重实时荧光PCR扩增(反应体系1),由图 1可见,FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道分别对应的炭疽杆菌capA基因、鼠疫耶尔森菌Pla基因、嗜肺军团菌Mip基因的扩增曲线图形呈标准S型,曲线光滑,ct值为 19~21,说明检测阳性,扩增情况稳定,效果良好。 2.2 第二反应体系检测结果(图 2)
注:1:JOE荧光通道(检测pilE基因);2:FAM荧光通道(检测 caf1基因);3:TAMRA荧光通道(检测PA基因) 图 2 三重实时荧光定量PCR 反应体系2 荧光曲线图

对组合的目标靶基因质粒标准品进行多重实时荧光PCR扩增(反应体系2),FAM 荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道分别对应的鼠疫耶尔森菌caf1基因、嗜肺军团菌pilE基因、炭疽杆菌PA基因的检测,也出现良好的阳性结果。

2.3 炭疽杆菌二重实时荧光PCR检测结果(图 3)
注:1: TAMRA 荧光通道(检测PA基因) ; 2: FAM 荧光通道(检测 capA基因) 。 图 3 炭疽杆菌二重实时荧光定量PCR 反应荧光曲线图

在单一反应孔内,对炭疽杆菌capA、PA靶基因进行二重实时荧光 PCR扩增,由图 3可见,FAM荧光通道、TRAMA荧光通道分别对应的capA基因、PA基因的扩增曲线良好。

2.4 鼠疫耶尔森菌二重实时荧光PCR检测结果(图 4)
注:1: FAM 荧光通道(检测caf1基因) ; 2: JOE 荧光通道(检测 Pla基因) 。 图 4 鼠疫耶尔森菌二重实时荧光定量PCR 反应荧光曲线图

对鼠疫耶尔森菌caf1、pla靶基因进行二重实时荧光PCR扩增,由图 4可见,FAM荧光通道、JOE荧光通道分别对应的caf1 基因、pla基因的扩增曲线良好。

2.5 嗜肺军团菌二重实时荧光PCR检测结果(图 5)
注:1: JOE 荧光通道(检测pilE基因) ; 2: TAMRA 荧光通道(检测 Mip基因) 。 图 5 嗜肺军团菌二重实时荧光定量PCR 反应荧光曲线图

对嗜肺军团菌Mip、pilE靶基因进行二重实时荧光PCR扩增,由图 5可见,TRAMA荧光通道、JOE荧光通道分别对应的Mip基因、pilE基因的扩增曲线良好。

2.6 干扰性、敏感性和特异性试验

将炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌不同的模板浓度进行组合,发现当2种细菌模板浓度较高而另1个细菌模板浓度较低,或2种细菌模板浓度较低而另1个细菌模板浓度较高时,所建立的方法依然可以同时检测到各个细菌,表明高浓度的模板对低浓度模板的扩增检测干扰不明显。敏感性试验中,单重实时荧光PCR 检测6个靶基因,均可检测到20拷贝数的质粒标准品;二重实时荧光定量PCR亦可检测到20拷贝数的质粒标准品;多重实时荧光PCR均可以可靠的检测到100拷贝数的质粒标准品,但当模板浓度更低时,重复性试验中扩增曲线可能不典型且Ct值往往> 38。特异性试验中,对阳性菌株均100%检出,对其他常见杆菌如沙门菌、志贺菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌等进行检测,均为阴性。

3 讨 论

本研究建立了能同时检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的2套体系的多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法,该2套体系的优点在于:一是两孔具有相同的反应参数(如变性、退火温度和延伸时间等),可在同一定量PCR仪器中同时进行反应;二是每孔都能对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的致病株进行侦检并作出独立的诊断,两孔同时进行,分别针对主要毒力因子基因和特异性结构蛋白基因检测〔11, 12, 13, 14〕,相当于复核和"双保险",还能鉴定出弱毒株甚至重组的生物战剂;三是分成2个体系后,已上市的绝大多数定量PCR仪(3~5个荧光通道)均与此方法兼容。由图 1和图 2的荧光曲线可见,两个体系的各引物对和各探针工作性能良好,互相间无干扰。由图 3、图 4、图 5可见,本研究还构建成功了分别检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的二重实时荧光定量PCR方法。建立的多重实时荧光PCR体系,抗干扰性强,特异性良好,在敏感性方面能可靠的检测到100拷贝数的质粒标准品,足以满足疫情检测需要。

本研究建立多重实时荧光PCR方法,在具有实时荧光定量PCR快速、敏感的特性同时,可以实现一管多检,达到省时省力的目的,提高了检测速度和效率,尤其适合疫情早期预警、排除所必须的同时筛查检测的需要,对于应对突发传染病疫情和流行病学调查,突发公共卫生事件应急处置的早期检测,反生物恐怖袭击预警等具有重要的意义。

参考文献
〔1〕 韩悦,周宝森,孙立华,等.疫区土壤中炭疽芽胞杆菌的分离鉴定及毒力测定[J].中国公共卫生,2004,20(6):740.
〔2〕 黄德蕙,梁江明,秦石英,等.胶体金免疫层法在鼠疫监测中应用效果评价[J].中国公共卫生,2008,24(2):209-210.
〔3〕 郭红梅.青藏铁路沿线鼠疫危险性及控制策略[J].中国公共卫生,2007,23(12):1508-1509.
〔4〕 张政,朱水荣,徐宝祥.嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(11):1978-1980.
〔5〕 袁梦,袁月明,俞慕华,等.嗜肺军团菌不同分子分型方法检测[J].中国公共卫生,2010,26(2):200-201.
〔6〕 Wagar EA,Mitchell MJ,Carroll KC,et al.A review of sentinel laboratory performance:identification and notification of bioterrorism agents[J].Arch PAthol Lab Med,2010,134(10):1490-1503.
〔7〕 Kintzer AF,Thoren KL,Sterling HJ,et al.The protective antigen component of anthrax toxin forms functional octameric complexes[J].J Mol Biol,2009,392(3):614-629.
〔8〕 Luna VA,King DS,Peak KK,et al.Bacillus anthracis virulent plasmid pX02 genes found in large plasmids of two other Bacillus species[J].J Clin Microbiol,2006,44(7):2367-2377.
〔9〕 Eren E,Murphy M,Goguen J,et al.An active site water network in the plasminogen activator pla from Yersinia pestis[J].Structure,2010,18(7):809-818.
〔10〕 Sambrook J,Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual(3rd ed)[M].Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001.
〔11〕 Suomalainen M,Haiko J,Ramu P,et al.Using every trick in the book:the Pla surface protease of Yersinia pestis[J].Adv Exp Med Biol,2007,603:268-278.
〔12〕 Ceymann A,Horstmann M,Ehses P,et al.Solution structure of the Legionella pneumophila Mip-rapamycin complex[J].BMC Struct Biol,2008,17:8-17.
〔13〕 Helbig JH,Benson RF,Pelaz C,et al.Identification and serotyping of atypical Legionella pneumophila strains isolated from human and environmental sources[J].J Appl Microbiol,2007,102(1):100-105.
〔14〕 Mohamadzadeh M,Durmaz E,Zadeh M,et al.Targeted expression of anthrax protective antigen by Lactobacillus gasseri as an anthrax vaccine[J].Future Microbiol,2010,5(8):1289-1296.