原发性高血压是一种遗传因素与环境因素相互作用所致的复杂性疾病,对原发性高血压的控制可以有效降低冠心病、 脑卒中等心脑血管疾病的发病风险。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)是一种常用的抗高血压药物,但不同个体对此类药物的反应差异很大,这可能与基因的多态性有关^〔1〕。近年来,多项研究表明血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在心脑血管疾病中发挥着重要的作用^{〔2, 3〕},此外,血管紧张素Ⅱ的1 型受体(angiotensinⅡtype1 receptor,AGTR1)、血管紧张素原 (angiotensinogen,AGT)与ACE2之间也存在一定关系。本研究为探讨ACE2基因rs2285666和rs2106809位点多态性与 ACEI类药物苯那普利降压水平的关系及AGTR1、AGT、ACE2 基因13个位点间的交互作用,于2010年5月对上海市南市区半淞园街道抽取的1 447例≥35岁高血压患者ACE2基因和血压水平以及AGTR1、AGT、ACE2间的交互作用进行分析。结果报告如下。

中单纯服用苯那普利且存有DNA样本的全部≥35岁的高血压患者共1447例。所有研究对象均为在上海市南市区半淞园街道居住≥5年的高血压患者,即重复测量收缩压≥140 mm Hg 或舒张压≥90 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)或目前正在服用抗高血压药物且无其他明确原因者^〔5〕;排除极重度高血压患者、瓣膜性心脏病患者、扩张及肥厚性心肌病患者、严重肝功能损害者、严重肾功能损害者、口服避孕药或皮质激素使用者、孕妇及哺乳期妇女、对苯那普利药物过敏者、联合使用其他药物者以及不能正确回答问题和不能准确表达意愿者。

采用自行设计问卷收集研究对象的一般人口学资料。由经过统一培训的调查员使用常规水银血压计测量血压,血压测量时取3次测量平均值作为检查结果。在首次就诊测量血压后,按照血压水平给予初始剂量的苯那普利(轻度高血压患者5 mg/d,中、重度高血压患者10 mg/d)进行治疗,轻、中、重度高血压的分类按美国全国联合委员会关于高血压检出、评价和治疗的第五次报告进行判定^〔5〕。血压变化指标(收缩压差值、舒张压差值、脉压差差值)使用首诊血压与末次随访血压值之差。采用实验室检查尿蛋白水平。

rs2285666位点基因型鉴定使用聚合酶链反应(PCR)测定方法,上游引物5'-CATGTGGTCAAAAGGATATCT- 3',下游引物5'-AAAGTAAGGTTGGCAGACAT-3'。 PCR反应体系:DNA模板100 ng,10 × PCR缓冲液2.5 μL,20 mmol/L的MgCl₂ 2.5 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,10 μmmol/ L上、下游引物各0.8 μL,2 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL。 反应条件:预变性94℃ 3 min;94℃变性1 min,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环10次;94℃变性1 min,60℃退火 1 min,72℃延伸1 min,循环15次;94℃变性1 min,58℃退火1 min,72℃延伸1 min,循环20次;最后72℃延伸8 min 终止反应。酶切反应体系:31 μL,其中扩增产物10 μL,10 × 缓冲液2 μL,双蒸水18 μL,AluⅠ内切酶1 μL (Fermentas快速酶)。在37℃条件下酶切15 min,酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶中电泳,溴化乙锭荧光染色,凝胶成像仪进行成像观察。AA基因型出现281和185 bp 2条带,GG基因型出现 466 bp 1条带,AG基因型出现上述3个长度的条带。由于 ACE2基因位于X染色体上,男性只有1条X染色体,表现为 A、G 2种基因型。rs2106809位点基因型检测方法参照文献^〔6〕。AGT的3个(rs4762、rs699、rs7079)和AGTR1的8个 (rs1492078、rs2276736、rs2638362、rs2640543、rs389566、 rs275649、rs5182、rs5186)位点基因型测定方法应用TaqMan技术^〔4〕。

应用SPSS 15.0软件进行t检验、方差分析、 多重线性回归分析。基因-基因交互作用使用广义多因子降维法采用GMDR软件(beta version 0.7)分析,交互验证次数定为10次,探索2~5个位点的基因-基因交互作用模型,得到最优模型(P < 0.05)后再进行1 000次置换检验。入组前部分研究对象血压处于正常水平,为防止这部分人对结果的干扰,本研究将把基线时血压达标(重复测量收缩压< 140 mm Hg且舒张压< 90 mm Hg)和未达标者(重复测量收缩压 ≥140 mm Hg或舒张压≥90 mm Hg)分别进行分析。

调查的1 447例高血压患者中,男性877例,占60.6%,女性570例,占39.4%;年龄35~86岁,平均年龄为(63.2 ± 10.2)岁;蛋白尿-、±、+、+ +、+ + +者分别为 1 176、122、117、22、10例,分别占81.3%、8.4%、8.1%、 1.5%、0.7%。

877例男性高血压患者基线收缩压为(148.8 ± 14.7) mm Hg,基线舒张压为(94.4 ± 8.4) mm Hg,基线脉压差为(54.4 ± 12.9) mm Hg;男性基线血压达标者89 例,占10.1%,基线血压未达标者788例,占89.9%;服用苯那普利剂量为5 mg/d者378例,占43.1%,服用剂量为10 mg/d者499例,占56.9%。570例女性高血压患者基线收缩压为(148.4 ± 15.6) mm Hg,基线舒张压为(92.4 ± 7.7) mm Hg,基线脉压差为(56.0 ± 13.7) mm Hg;女性基线血压达标者92例,占16.1%,基线血压未达标者478例,占83.9%;服用苯那普利药物剂量为5 mg/d者314例,占55.1%,服用剂量为10 mg/d者256例,占44.9%。

共成功鉴定rs2285666基因型者 1 230例,其中男性746例,占60.7%,女性484例,占39.3%; 其中基因型为A和G的男性分别为430和316例,分别占 57.6%和42.4%;基因型为AA、AG和GG的女性分别为 158、217和109例,分别占32.7%、44.8%和22.5%。共成功鉴定rs2106809基因型者1 142例,其中男性668例,占 58.5%,女性474例,占41.5%;其中基因型为C和T的男性分别为391和277例,分别占58.5%和41.5%;基因型为CC、 CT和TT的女性分别为166、211和97例,分别占35.0%、 44.5%和20.5%。

表 1

表 1 rs2285666 位点不同基因型个体服药后血压变化指标比较

表 1 rs2285666 位点不同基因型个体服药后血压变化指标比较

未调整相应年龄、基线血压指标、首诊药物剂量、尿蛋白水平时,rs2285666位点不同基因型间的血压变化指标差异均无统计学意义(P > 0.05);经调整年龄、基线血压指标、首诊药物剂量和尿蛋白水平后,基线血压达标者中,rs2285666位点与男性脉压差差值有关联(β=0.24,95% CI:0.40~4.36,P=0.02)。

表 2

表 2 rs2106809 位点不同基因型个体服药后血压变化指标比较

表 2 rs2106809 位点不同基因型个体服药后血压变化指标比较

未调整相应年龄、基线血压指标、首诊药物剂量、尿蛋白水平时,rs2106809位点不同基因型间的血压变化指标差异均无统计学意义(P > 0.05);经调整年龄、基线血压指标、首诊药物剂量和尿蛋白水平后,rs2106809位点与男性收缩压差值有关联(β=0.23,95% CI:0.15~4.93,P=0.04);基线血压未达标者中,rs2106809位点与女性收缩压差值有关联(β=-0.06,95% CI:-2.25~-0.03,P=0.04)。

表 3

表 3 GMDR 方法获得的基因－基因交互作用模型

表 3 GMDR 方法获得的基因－基因交互作用模型

共有996例患者测得 AGTR1基因的8个位点(rs5182、rs275649、rs2276736、 rs2638326、rs389566、rs2640543、rs5186、rs1492078)、AGT基因的3个位点(rs699、rs4762、rs7079)和ACE2的2个位点 (rs2285666、rs2106809),其中男性626例,占62.9%,女性370 例,占37.1%。对以上13个位点进行交互作用分析结果表明,男性收缩压变化值得到1个3位点的最优模型,此3个位点分别来自所研究的3个基因;女性收缩压变化值得到1个 2位点的最优模型,其中1个位点来自AGTR1基因,另1个位点来自AGT基因;女性舒张压变化值得到1个3位点的最优模型,此3个位点也分别来自所研究的3个基因。

Tikellis等^〔7〕研究表明,敲除ACE2基因的小鼠使用ACEI 后降压效果减弱;Ferrario等^〔8〕发现使用ACEI后ACE2 mRNA 的表达及Ang-(1-7)水平升高。本次研究结果表明,rs2285666和rs2106809位点与服用ACEI类药物后的血压变化值有关,提示ACE2可能参与ACEI的降压机制。Fan等^〔2〕 对卡托普利降压效果的研究表明,rs2285666位点与男性和女性收缩压和舒张压变化值无相关性,与本研究结果相似。陈卿等^〔6〕的研究表明,rs2106809位点与男性脉压差变化值和女性收缩压及脉压差变化值有相关性,与本研究结果不同,这可能与该研究关注的是药物短期疗效有关。目前关于ACE2 基因多态性与ACEI降压效果的研究较少且无一致结论,需进一步研究加以验证。

既往研究结果表明,AGTR1和AGT基因不但与高血压有相关性,与服用苯那普利后血压变化值也有相关性^{〔4, 9, 10〕}。 本研究结果表明,此2个基因还可能联合ACE2进行血压的调节。其机制可能是:ACEI类药物能够降低ACE的作用,减少AngⅡ生成,从而减少AngⅡ与AGTR1的结合,发挥降压作用。同时,AGT可以影响AngⅡ的含量,改变AngⅡ和Ang-(1 -7)的比例。一方面,ACE2可根据该比例来调节血压;另一方面,该比例又会影响AGTR1基因的表达^〔11〕,而AGTR1的表达又能够抑制ACE2的表达与活性^〔12〕。综上所述,本研究发现ACE2基因多态性与高血压患者服用苯那普利后的长期疗效有关,并且ACE2基因与AGTR1、AGT基因共同影响血压变化,这为高血压患者的个体化用药及新型药物的研发提供了一定的参考依据,但本研究仅纳入了3个基因的13个位点,对基因所在区域覆盖不够全面,虽然发现了部分交互作用的证据,但模型尚未全面反映各基因的相互联系,因此,在今后的研究中应加以改进。