氧化应激是许多疾病发病过程中的致病环节,是指机体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成增加和(或) 清除能力降低。ROS具有重要的生理作用,但过量则会引起分子、细胞和机体的损伤^〔1〕。ROS直接参与了2型糖尿病、 高血压、冠心病、老年痴呆、骨质疏松等多种老年相关性疾病的病理过程^〔2〕。有研究证实,桑叶黄酮通过抗氧化机制清除自由基,保持胰岛β细胞及结构完整,从而降低糖尿病患者血糖水平,并阻止并发症的发生^〔3〕。本研究以高脂饮食喂养 SD大鼠,建立具有胰岛素抵抗特征的2型糖尿病大鼠模型,旨在观察桑叶黄酮对其氧化应激作用,并探讨其改善胰岛素抵抗的分子机制。

(1)实验动物:7周龄SPF级雄性SD大鼠60只 (重庆医科大学实验动物中心,许可证号:重医大[2008]127 号、渝发改技[2008]1179号),体重160~170 g。(2)主要仪器与试剂:桑叶黄酮(徐州托康科技有限公司,经大孔树脂纯化,干品含量为612.3 mg/g)。康乐全血糖仪及同批号血糖试纸(瑞士罗氏公司);KJ-201 BD型振荡器(江苏康健医疗器具有限公司);紫外分光光度计(美国Beckman公司);电热恒温培养箱(上海跃进医用光学器械厂)。大鼠胰岛素ELISA 试剂盒(美国BPB Biomedicals公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程公司)。

所有大鼠饲养于动物房,室内温度为23~25℃,2只一笼,自由摄食和饮水,12 h明暗交替照明。适应性喂养1周后开始分组喂养。随机取14只大鼠为对照组(NOR组),正常普通饲料喂养;其余46只大鼠予高脂饲料喂养^〔4〕,成分为脂肪57.5%,蛋白质18.6%,碳水化合物23.9%。饲养7周后,高脂组大鼠给予一次性腹腔注射pH 4.6含链脲菌素0.5%的柠檬酸缓冲液25 mg/kg,对照组注射柠檬酸缓冲液25 mg/kg。8周末禁食12 h后取尾静脉血测空腹血糖(fasting blood glucose,FPG)和胰岛素(insulin,FINS),以FPG≥7.0 mmol/L,伴有胰岛素抵抗为造模成功标准^〔5〕,成功造模31只,随机分成糖尿病模型组(MOD组)16只和桑叶黄酮治疗组(MLF组)15只。NOR组和MOD组每天40 mg/kg 生理盐水灌胃,MLF组桑叶黄酮每天40 mg/kg灌胃,共干预4 周。最后一次灌胃12 h后,各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉,眼眶取血,测FPG,常规分离血清,-20℃冰箱保存备用,以检测有关指标。迅速解剖,分别取肝组织、附睾脂肪等液氮速冻,然后放-70℃冰箱保存,备检。

参照说明书用大鼠胰岛素ELISA试剂盒检测FINS。分别参照文献〔6〕和〔7〕计算胰岛素敏感指数 (insulin sensitivity index,ISI)和胰岛素抵抗指数(insulin resistance index,IRI)。

参照说明书用试剂盒测定血清 MDA、SOD、GSH-Px活性。

应用SPSS 12.0软件进行t检验。

表 1

表 1 干预4 周后各组FPG、FINS、ISI 、IRI 比较(x±s)

表 1 干预4 周后各组FPG、FINS、ISI 、IRI 比较(x±s)

MOD组FPG、FINS和IRI均明显高于NOR组,而ISI较NOR 组明显降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。MLF组能降低糖尿病大鼠FPG、FINS和IRI并升高ISI,与MOD组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 2

表 2 干预4 周后各组MDA、SOD、GSH-Px 比较(x±s)

表 2 干预4 周后各组MDA、SOD、GSH-Px 比较(x±s)

与NOR组比较,MOD组大鼠血清SOD、GSH-Px活力降低,MDA含量升高,差异均有统计学意义(P < 0.05);MLF组血清SOD、GSH-Px活力升高,MDA含量降低,与MOD组比较,差异均有统计学意义(P < 0.05)。

有研究表明,氧化应激在胰岛素抵抗介导的2型糖尿病起始及发生发展过程中发挥着重要作用^〔8〕,可以导致胰岛素抵抗^〔9〕。本研究结果表明,与对照组比较,2 型糖尿病胰岛素抵抗大鼠血清MDA水平均上升、SOD活力和抗氧化防御能力均降低,发生氧化应激,直接引起生物膜脂质过氧化等,导致脂肪细胞炎症的发生,释放大量炎症因子,进一步加重胰岛素抵抗,形成"高血糖→氧化应激→脂肪炎症→胰岛素抵抗→ 高血糖"恶性循环。本研究结果还显示,桑叶黄酮能改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的高胰岛素血症,降低血糖,提高胰岛素敏感性。桑叶黄酮能明显降低MDA水平,提高SOD、GSHPx 活性,降低氧化应激水平,抑制脂质过氧化产物的形成,从而减轻氧化损伤,提高清除自由基能力,增强机体的抗氧化能力。因此,天然黄酮类化合物通过抗氧化起到抗糖尿病的作用日益受到人们的关注,为2型糖尿病的药物治疗开辟了新途径。