原花青素(procyanidins,PC)是由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成的一类多酚化合物的总称,在水果、蔬菜和饮料中含量丰富。1961年德国Karl等从山楂新鲜果实提取物中首次分离得到原花青素^〔1〕,此后人们相继在葡萄、山楂、花生、银杏等植物中发现原花青素。各国学者对上百种植物原花青素尤其对食物原花青素进行了广泛研究,发现其具有抗氧化、抗衰老、增强心血管活性等多种生物活性和药理作用^{〔2, 3, 4〕}。近年来研究显示,原花青素不仅可抑制乳腺癌、肺癌、慢性骨髓白血病、前列腺癌等肿瘤细胞的生长,还可以诱导多种肿瘤细胞凋亡^{〔5, 6〕}。本研究拟观察葡萄籽原花青素(proanthocyanidins from grape seeds,GSP)对骨髓间质干细胞来源的F6细胞^〔7〕凋亡作用,结果报告如下。

F6细胞系(江苏大学基础医学与医学技术学院检验医学研究所);低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium-low glucose,L-DMEM)、胎牛血清(美国BD公司);3H-TdR(中国原子能进出口公司);琼脂粉(美国Sigma公司);DNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司);GSP(天津市尖峰天然产物研究开发有限公司,纯度>95%,用磷酸盐缓冲液配制成1mg/mL溶液,分装,-20℃储存)。FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);LS-6500液体闪烁仪(美国BECKMAN COULTER公司)。

F6细胞采用含体积分数10%胎牛血清的LDMEM培养基,置于37℃含5%CO₂培养,体积分数0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)消化、传代细胞。

将F6细胞消化、洗涤、计数后以5×10⁴个细胞种于96孔板中,实验分为6组:终浓度为50、75、100、150、200μg/mLGSP组及对照组,在37℃、5%CO₂条件下培养48h后,每孔加入1μCi的³H-TdR继续培养12h。用多头细胞样品收集器收获细胞于玻璃纤维纸上,晾干,放入样品测试杯中并加入闪烁液,用液体闪烁仪测定每孔细胞3H-TdR的CPM值。同上操作,使用³H-TdR掺入法测定终浓度为50μg/mL的GSP分别与F6细胞作用0、12、24、48、72h后的CPM值。

将F6细胞消化、洗涤、计数后以1×10⁶个细胞种于6孔板中,将终浓度为50μg/mL的GSP分别与F6细胞作用0、12、24、48、72h,收集细胞,根据DNA提取试剂盒使用说明书提取DNA,使用琼脂糖电泳检测DNA条带变化。

将F6细胞消化、洗涤、计数后以1×10⁶个细胞种于6孔板中,将终浓度为50μg/mL的GSP分别与F6细胞作用0、12、24、48、72h后收集细胞,碘化丙啶(PI)与Annexin-V双染细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

实验数据以x ± s表示,组间均数差异采用t检验。数据分析采用STAT 7.0统计分析软件。P＜0.05为差异有统计学意义。

对照组及50、75、100、150、200μg/mLGSP组CPM值分别为(145568.7±16864.4)、(59653.1±18032)、(32095.6±15915.3)、(4524±1262)、(1743.7±806)、(3338.3±723.3),结果显示GSP对F6细胞增殖有明显抑制作用,且随着GSP浓度增加抑制程度加大(t=13.38~22.4,P＜0.01)。终浓度为50μg/mL的GSP分别与F6细胞作用0、12、24、48、72h后,CPM分别为(27463.6±2083.4)、(20008.3±3169.2)、(17423.4±2489.3)、(17039±2509.2)、(3604±1628.9),结果显示GSP明显抑制了F6细胞的增殖且随着作用时间延长效果越明显(t=5.74~18.37,P＜0.01)。

图 1

注: M: Marker; 1～5泳道: 分别为GSP与F6细胞作用0、12、24、 48、72 h。 图 1 DNA ladder检测GSP对F6细胞作用

DNA ladder检测显示终浓度为50μg/mLGSP分别与F6细胞作用12、24、48、72h后诱导F6细胞凋亡,表现出特征性DNA ladder,而对照组则未出现。

F6细胞经终浓度为50μg/mL的GSP分别作用0、12、24、48、72h后凋亡细胞占总细胞百分比分别为0.03%、10.37%、9.2%、7.9%、5.53%,与对照组比较,GSP组细胞发生了明显凋亡。

近年研究显示原花青素具有抗氧化、抑制乳腺瘤、肺癌、前列腺癌等肿瘤生长作用,还具有拮抗化疗药物对正常细胞的毒性作用^〔8〕。F6细胞是由人胚胎骨髓间质干细胞在体外培养时经粒-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4诱导分化而来的细胞系,具有骨髓间质干细胞和肿瘤细胞特征,即具有肿瘤干细胞特性^〔9〕。本研究结果显示当使用不同浓度GSP作用于F6细胞时,GSP终浓度≥50μg/mL时随着GSP浓度增加,F6细胞数量不断减少,表明GSP抑制了F6细胞增殖。而当使用终浓度为50μg/mL的GSP于不同时间作用于F6细胞时发现,随着作用时间延长,GSP抑制F6细胞增殖的作用越明显。终浓度为50μg/mL的GSP作用于F6细胞12、24、48、72h时均出现细胞染色质DNA断裂,琼脂糖凝胶电泳呈现特性的DNAladder。而FCM检测发现GSP作用过的F6细胞发生了凋亡。可见GSP通过诱导F6细胞的凋亡来抑制其增殖,其确切作用机制有待于进一步深入研究。