镰刀菌属是真菌中较大的一个属,分布极为广泛^〔1〕。镰刀菌分泌产生的毒素种类很多,其中对人类危害最大的主要是玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN、ZEA)、伏马菌素(fumonisin,F)和单端孢霉烯族化合物等。其中根据单端孢霉烯族化合物分子上功能基团的类型,又将其分为A和B两类,A类主要为T-2毒素,B类主要为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)。这几种毒素是食品中最普遍存在的镰刀菌毒素,与人类的健康关系密切。镰刀菌毒素检测方法尤其是灵敏快速的免疫学检测方法研究,对提高粮食质量安全,预防其毒害作用具有重要的意义。本文就镰刀菌毒素危害及其人工抗原制备的研究动态进行综述。

玉米赤霉烯酮(ZEN,ZEA)又称F-2毒素,是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、粉色镰刀菌等镰刀菌在生长过程中所产生的次级代谢产物,属于雷索酸内酯类甾体类同化激素^〔2〕。ZEN纯品为白色结晶,其化学名为6-(10羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯,分子量为318.36,分子式为C₁₈H₂₂O₅。熔点为161~163℃,不溶于水、二硫化碳和四氧化碳,溶于碱性溶液、乙醚、甲醇、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和酸类。

食品生产所用谷物是ZEN产生的最好基质。谷物在生长、收获过程以储藏、使用等诸多环节中,均有可能受到ZEN的污染^〔2〕。Placinta等^〔3〕对20多个国家谷物中的霉菌毒素污染进行调查研究,其中大多数国家的谷物中不同程度的受到ZEN污染。该毒素不仅污染谷物、饲料,对动物造成毒性,而且还能够通过污染或残留ZEN的肉、乳等动物源性食品进入人体,给人的健康造成威胁。ZEN与内源性雌激素在结构上相似,能像雌激素一样,通过与雌激素受体竞争性的结合,激活雌激素反应元件,使受体发生二聚化,从而发生一系列拟雌激素效应^〔2〕,严重影响哺乳动物的生殖器官及其功能。余增丽等^〔4〕通过观察环境雌激素ZEN对雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF27肿瘤相关基因表达的影响发现,ZEN对相关肿瘤的发生发展起促进作用并具有一定的致癌性。

伏马菌素(F)是上世纪80年代末期发现由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物^〔5〕,目前已经发现有11种,分别是FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP。其中FB1是伏马菌素的主要组成成分,占总量的70%,也是导致伏马菌素毒性作用的主要因素^〔6〕。FB1分子量为721.83,分子式为C₃₄H₅₉O₁₅N。易溶于水,且具有热稳定性,100℃蒸煮30min也不能破坏其结构,150℃半衰期为10min,75℃半衰期为8h^〔7〕。

伏马菌素是对人类危害很大的真菌毒素之一。伏马菌素种类较多,在粮食及其制品中也均有检出。主要污染玉米及其制品,也可污染小麦、稻米等粮食作物及其制品。伏马菌素在结构上与神经鞘氨醇相似,能够特异性地干扰神经鞘脂类在体内的代谢。研究表明,伏马菌素具有致癌性、肺毒性、神经毒性、免疫系统毒性等^〔8〕。1993年,国际癌症研究机构将伏马菌素列为2B类致癌物质(即人类可能致癌物)。可诱发人类食道癌^〔9〕、肝癌等疾病,也可导致马白脑软化症、猪肺水肿综合症。另外,伏马菌素污染的粮食中常伴有黄曲霉毒素存在,更增加了其对人畜危害的严重性^〔10〕。

T-2毒素是单端孢霉烯族毒素之一,主要产生菌是镰孢菌属,如拟枝孢镰刀菌、枝孢镰刀菌等。T-2毒素是一种倍半萜烯化合物,纯品为白色针状结晶,化学名为4β-1,15-二乙酰氧基-8α-(3-甲基丁酰氧基)-12,13-环氧单端孢霉-9烯-α醇,分子量为466.22,分子式为C₂₄H₃₄O₉。T-2毒素易溶于极性溶剂,性质稳定,熔点为151~152℃,室温下放置6~7年或者加热至200℃1~2h毒力仍无减弱,而碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性^〔11〕。

T-2毒素作为一种在自然界中广泛存在真菌毒素,主要污染小麦、大麦等粮食作物及其制品,对人类健康构成了较大危害。主要有以下几方面强烈毒性:细胞毒性,免疫抑制,致畸性、致癌性和催吐等^〔11〕。T-2毒素主要作用于增值活跃的细胞,如骨髓、肝、粘膜上皮和淋巴细胞等,对淋巴细胞的损害最为严重。T-2毒素中毒后的一般临床症状为厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍等。该毒素能抑制细胞蛋白质及DNA合成,干扰生物体能量和脂类代谢,对生物膜功能及多种酶活性也有明显作用。T-2毒素还可引起机体过氧化损伤,该毒素是体内蛋白质合成的抑制剂,人畜误食病谷后,严重时可损伤造血组织,造成伤亡。此外,T-2毒素可能还与某些地区大骨节病、食管癌和克山病的高发病率有关^〔12〕。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是最易检测到的单端孢霉烯族化合物,主要由禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。由于它可以引起猪的呕吐,故又名呕吐毒素(vomitoxin,VT)^〔13〕。DON为无色针状结晶,化学名为3,7,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮,分子量为296.3,分子式为C₁₅H₂₀O₆。熔点为151~153℃。易溶于水和极性溶剂,但不溶于正己烷和乙醚。化学性能非常稳定,具有较强的热抵抗力和耐酸性,在pH10条件下100℃加热60min部分被破坏,120℃加热30min和170℃加热15min完全被破坏。

DON主要污染玉米、大麦、小麦等谷类作物及制品,对人体有很强的毒性,1993年国际癌症研究机构也将该毒素列为2B类致癌物。因此,各国均对谷物及饲料中DON的含量制定了严格的限量标准,例如,美国食品和药物管理局规定小麦及其制品中DON的含量不得超过1.0mg/kg,中国国家标准GB2761-2005规定在食用小麦及玉米中DON的限量为1000μg/kg。DON毒性包括胚胎毒性、细胞毒性、免疫毒性、致畸性、弱致癌性,食入污染严重的粮谷类食品后会对人体健康造成严重危害^{〔14, 15〕}。细胞毒性表现在它对于生长较快的细胞如胃肠道黏膜细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、脾细胞、骨髓造血细胞等均有损伤作用,并且可以抑制蛋白质的合成^〔16〕。免疫毒性表现为呕吐毒素通过其倍半萜烯结构抑制转录、翻译过程,在人体内,呕吐毒素可以抑制对病原体的免疫应答^〔17〕。

以单克隆抗体为基础的ELISA方法具有简单、快速、费用低廉、高灵敏度、高特异性等特点,在镰刀菌毒素快速检测领域有着极高的应用价值。ELISA检测中要求有特异性高的单克隆抗体,镰刀菌毒素是小分子物质,属于半抗原,只有反应原性,无免疫原性,需与大分子物质(如蛋白质等)偶联后,制备出人工完全抗原,利用大分子的T细胞表位刺激机体,才能产生抗体特异性免疫应答^〔18〕。因此,能否制备出具有良好免疫原性的人工抗原是镰刀菌毒素ELISA快速检测中最关键的一步。

玉米赤霉烯酮分子上中含有一个酚羟基,因此它的人工抗原制备方法多先进行分子改造,然后再与蛋白质进行偶联。王景琳等^〔19〕先将玉米赤霉烯酮与盐酸羧甲基羟胺反应得到改造的半抗原即玉米赤霉烯酮-6-羧甲氧肟(其带有游离的羧基),再利用活泼酯法将改造后的半抗原与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)结合成完全抗原。Teahima等^〔20〕先用亚硝酸钠将ZEN硝化为5-硝基-ZEN,再与次硫酸钠反应生成5-氨基-ZEN,然后利用戊二醛法与BSA进行偶联得到人工抗原,最终获得的单抗灵敏度为0.3ng/mL。

FB1上含有多个游离的羧基,因此可以利用碳化二亚胺法将FB1与载体蛋白进行偶联制备人工抗原,Yu等^〔21〕成功利用碳二亚胺法制备了FB1人工抗原,获得的单抗IC₅₀为20.1ng/mL。邢淑婕^〔22〕也利用此方法制得人工抗原免疫小鼠后,所得多抗血清效价可达1:23000。FB1上含有一个游离的氨基,利用氨基可以直接与蛋白质的羧基偶联,氨基的偶联方法常用戊二醛法。戊二醛的两个醛基可以分别与两个分子上的氨基形成Schiff氏碱,将两分子以五碳链的桥连接起来。宫慧芝等^{〔23, 24〕}采用戊二醛一步法连接FB1与载体蛋白,在制备单抗基础上,利用间接竞争ELISA方法研制的FB1快速检测试剂盒最低检出浓度为5ng/mL。

T-2毒素分子中含有一个羟基,可以利用这个羟基进行人工抗原的合成。Chu等^〔25〕首先在T-2毒素侧链C3位置上的经基引人活性基因,通过与琥珀酸酐反应形成T-2-HS,然后在碳二亚胺的作用下与BSA结合合成了T-2-HS-BSA人工抗原,应用合成抗原进行免疫小鼠,获得了多克隆血清抗体。徐娟等^〔26〕和江涛等^〔27〕也通过上述方法合成了人工抗原,并通过紫外扫描和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳鉴定偶联成功。王雄等^〔28〕在此方法基础上又进行了改进,利用活泼酯法使T-2HS在N,N'-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺作用下与载体蛋白偶联合成完全抗原,最终获得的单抗IC₅₀为3.6ng/mL。

DON分子上含有一个羟基,所以要先对分子进行改造,然后再与载体蛋白偶联。邓舜洲等^〔29〕先用丁基硼酸封闭DON的7,15-羟基,然后用戊二酸酐酰化3-羟基,制备了含有羧基的3-HG-DON,通过活泼酯法将3-HG-DON偶联到载体蛋白OVA,制备检测抗原,采用碳二亚胺检测法将DON分子与载体蛋白MBSA偶联制备的免疫抗原,利用此完全抗原免疫小鼠,获得的小鼠血清多抗效价达1:25600。王俊双等^〔30〕也通过活泼酯法制备了人工抗原,不同的是他利用丁二酸酐酰化3-羟基。祭芳等^〔31〕用琥珀酸酐酰化3-羟基,制备了含有羧基的3-HS-DON,然后采用碳二亚胺法将3-HS-DON与载体蛋白进行偶联,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定偶联成功,并通过免疫小鼠制备出多克隆抗体。

综上所述,镰刀菌毒素性质稳定,毒性不因普通的加热而被破坏,是危险的食品污染物,对人体健康危害严重,常导致各种急性、慢性中毒的发生,还有致癌、致畸、致突变的潜在危害。随着人们生活水平的日益提高,食品安全问题越来越受到重视,解决镰刀菌毒素可能造成的食品污染问题已迫在眉睫,但镰刀菌毒素对粮食的污染往往不易被人们所注意,因此针对镰刀菌毒素的ELISA检测方法就显得尤为重要。快速灵敏的ELISA方法都要基于特异性高,灵敏度好的单抗,而要制备出这样的单抗,首先要制备出具有良好免疫原性的人工抗原。随着人工抗原制备方法的逐步改进和完善,ELISA方法在毒素和有毒化合物等小分子化合物的检测中将会得到更广泛的应用,并且会对食品安全产生深远影响。