缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic entepholopathy,HIE)为新生儿期危害最大的常见病之一。由窒息引起的缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)至今仍是导致脑瘫、智力低下以及癫痫等多种慢性伤残情况的常见原因,给家庭社会造成巨大负担。因此阐明HIBD发病机制并寻找积极有效的治疗措施成为国内外共同关注的课题^{〔1, 2〕}。研究表明,孕酮在缺氧缺血脑损伤发病过程中起到了保护脑组织的作用,孕酮具有拮抗自由基产生,抑制细胞凋亡等作用^{〔3, 4〕}。本研究通过观察孕酮对新生鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织中孕酮受体表达影响,从分子水平探讨其神经保护作用及其机制。

7日龄Wistar大鼠(新乡医学院实验动物中心)30只。体重12~18g。随机分成假手术,缺氧缺血,孕酮干预(缺氧前30min按8mg/kg腹腔注射浓度为0.5g/L的孕酮溶液)3组,每组各10只。

新生大鼠用乙醚麻醉,分离左侧颈总动脉,丝线结扎,将动物置于37℃恒温的密闭容器中,以1.5L/min的速度通入80mL/L氧气和920mL/L氮气的混合气体2.5h制备缺氧缺血动物模型。假手术组仅分离左侧颈总动脉,不结扎,亦不进行缺氧处理。

实验动物于HIBD后24h处死,迅速取脑,自视交叉后切分,置于10%福尔马林中固定过夜,常规脱水、透明、石蜡包埋,5μm切片,脱蜡至水、烤片,置4℃冰箱保存备用。孕酮受体免疫组织化学染色按试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司)使用说明进行。孕酮受体蛋白表达阳性细胞,胞浆和胞核呈棕黄色。在400倍光镜下随机观察皮质6个视野,计数视野内孕酮受体染色阳性细胞,以平均值作为阳性细胞数。

采用Trizol试剂从大鼠的脑组织中提取总RNA,并用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将其逆转录合成cDNA,产物置-20℃保存备用。采用β-actin作为PCR内参,上游引物5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3',下游引物5'-GCTAGGAGCCAGGGCAGTA-3',产物长度280bp。孕酮受体上游引物5'-AACTGGTTCCGCCACTCAT-3',下游引物5'-TCAGGGTTATCTGGTCATCG-3',产物长度460bp。引物由上海生物工程有限公司合成,PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,Bander leader3.0凝胶图像处理软件进行灰度分析,孕酮受体与β-actin条带灰度值之比作为目的基因mRNA水平的相对指标。

采用SPSS 12.0软件进行统计分析,数据用x ± s表示,成组设计的两样本均数比较采用t检验,P＜0.05为有统计学意义。

缺氧缺血组孕酮受体蛋白表达阳性细胞数为(21.57±1.88)个,明显低于假手术组(30.22±2.16)个,差异有统计学意义(P＜0.05);孕酮干预组孕酮受体阳性细胞数为(53.46±5.37)个,与缺氧缺血组比较,孕酮受体蛋白表达明显增多,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图 1

图 1 各组大鼠孕酮受体mRNA表达情况

各组大鼠孕酮受体mRNA表达水平差别明显。孕酮受体mRNA在缺氧缺血组大鼠的脑组织中的表达水平(0.47±0.26)比假手术组(0.93±0.31)明显减少,(P＜0.05)而孕酮干预组中的表达水平(0.78±0.27)与缺氧缺血组比较,明显升高(P＜0.05)。

孕酮亦称黄体酮(progesterone,PROG)是天然的孕激素,研究表明,孕酮不仅与神经元的发育分化、突触的可塑性、神经递质释放、学习记忆有关,对一些脑血管疾病如缺氧缺血性脑病、血管性痴呆等也有直接保护效应^{〔6, 7〕}。近几年,孕酮对脑损伤保护作用的实验研究及作用机制已成为研究热点。预防性给缺氧缺血性脑损伤大鼠腹腔注射孕酮溶液,可以拮抗脑组织自由基的产生,抑制细胞凋亡等作用^〔8〕。本实验结果显示,孕酮干预能明显增强孕酮受体表达。孕酮为小分子脂溶性神经活性甾体激素,易于透过血脑屏障,进入脑后对脑结构和功能产生影响。在脑组织内有孕酮受体存在,也有其受体mRNA的存在。孕酮的作用模式是进入脑细胞与核内受体结合,调节基因的表达从而发挥其神经保护作用。研究发现,孕酮结合孕酮受体后,可以通过激活孕酮受体介导的Src-ERKI/2促细胞存活通路和PI3K抗细胞凋亡通路,发挥保护缺血性脑损伤的作用^{〔9, 10〕}。