中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (9): 1141-1143   PDF    
引用本文
王晓琼, 仇小强, 张明, 钟秋安, 谭盛葵, 邓莹莹. 叶酸对柯萨奇病毒B3诱导乳鼠心肌凋亡保护作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(9): 1141-1143.
WANG Xiao-qiong, QIU Xiao-qiang, ZHANG Ming, et al. Prtoective effact of folic acid on myocardial apoptosis of offspring rats with maternal coxsackievirus B3 infection[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(9): 1141-1143.
叶酸对柯萨奇病毒B3诱导乳鼠心肌凋亡保护作用
王晓琼, 仇小强 , 张明, 钟秋安, 谭盛葵, 邓莹莹    
桂林医学院附属医院心内科, 广西桂林541001
收稿日期: 2010-08-18.
基金项目: 广西自然科学基金重点项目(2010GXNSFD013054),广西自然科学基金(桂科青0832046)
作者简介: 王晓琼(1983- ),女,河南平顶山人,医师,硕士,研究方向:先天性心脏病的预防与控制。
通讯作者: 仇小强,E-mail:xqqiu@glmc.edu.cn
摘要: 目的 探讨叶酸对柯萨奇病毒B3诱导的乳鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因与蛋白表达的影响。方法 取成熟健康雌性Wistar大鼠随机分为4组,分别为对照、叶酸、柯萨奇病毒B3及柯萨奇病毒B3+叶酸组;孕前灌胃给予叶酸2周,孕第5 d腹腔注射给予柯萨奇病毒B3,连续5 d;取自然分娩乳鼠心肌细胞,切片观察乳鼠心肌损伤;原位末端标记法(tunel)检测乳鼠心肌细胞凋亡;蛋白免疫印迹(western blot)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定乳鼠心肌细胞凋亡相关Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白及基因表达。结果 柯萨奇病毒组乳鼠心肌细胞损伤明显,凋亡细胞增加,加用叶酸后状态改善;病毒组乳鼠心肌细胞Bax、Caspase-3蛋白表达(0.608±0.060,0.951±0.038)及基因表达(0.951±0.098,0.960±0.074)高于病毒+叶酸组,病毒组Bcl-2蛋白表达(0.350±0.037)及基因表达(0.423±0.051)低于病毒+叶酸组。结论 怀孕母鼠早期感染柯萨奇病毒可致乳鼠心肌细胞凋亡增加,补充叶酸对乳鼠心肌细胞凋亡具有明显保护作用。
关键词: 叶酸     柯萨奇病毒B3     心脏细胞     细胞凋亡    
Prtoective effact of folic acid on myocardial apoptosis of offspring rats with maternal coxsackievirus B3 infection
WANG Xiao-qiong, QIU Xiao-qiang , ZHANG Ming, et al    
Department of Cardiovascular Internal Medicine, Guilin Medical University, Guilin 541004, China
Abstract: Objective To investigate the effects of oral folic acid on myocardial apoptosis of offspring in an experimental model of coxsackievirus B3(CVB3)infection of pregnant rats.Methods Wistar rats were randomly divided into four groups.Female rats in each group were copulated with normal male rats.After natural birth,the hearts of neonates were taken and stored in liquid nitrogen.Myocardial pathological changes were observed for the neonatal rats.Myocardial apoptosis was quantitated with terminal doxynucleotidyl transfernase mediated nick end labeling assay.RT-PCR and western blot were adopted to detect apoptosis associated proteins.Results For the pregnant rats injected with CVB3,the myocardial cell injury was significant in their offspring rats under optical microscopy.The increases in Bax,caspase-3 mRNA(0.951± 0.098,0.960±0.074)and protein(0.608±0.060,0.951±0.038)level were detected in CVB3 group compared with those of folic acid+CVB3 group(0.496±0.076,0.685±0.049;0.854±0.088,0.814±0.097).The expression levels of Bcl-2 mRNA(0.592±0.063)and protein(0.435±0.041)were increased in folic acid+CVB3 group compared with those of CVB3 group(0.350±0.037,0.423±0.051).Conclusion Folic acid supplementation can effectively inhibit myocardial cell apoptosis of the offspring of the rats injected with CVB3.
Key words: folic acid     coxsackievirus B3     cell apoptosis    

近年来发现细胞凋亡与心血管疾病密切相关,各种外因(病毒细菌感染、电离辐射、自由基、营养素缺乏、缺血性损伤)均可诱导细胞凋亡,心脏发育是一个复杂而精密过程,增殖与凋亡起重要作用,此时病毒感染引起增殖过少或凋亡过多均可直接或间接导致病理学后果,如先天性心脏病或心肌发育不良等〔1〕。Antti等〔2〕在实验中发现,在感染柯萨奇病毒B后可导致心肌细胞产生凋亡,还证实在心肌炎症的早期病毒的复制将触发凋亡的发生。本研究通过观察叶酸对柯萨奇B3病毒诱导的乳鼠心肌细胞凋亡影响,探讨叶酸对抑制细胞凋亡,维持组织发育平衡,增强宿主防御能力的作用。

1 材料与方法1.1 实验动物

健康成熟雌性和雄性Wistar大鼠(广西医科大学动物实验中心)各40只,体重约250~300g,饲养于SPF环境,饲养条件为室温22~25℃,湿度40%~60%,动物许可证号SCXK(桂)2009-0002。

1.2 试剂与仪器

叶酸粉剂、trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Promiga公司);Taq酶(日本TaKaPa公司);引物合成(上海生工生物公司);原位末端标记法(TUNEL)试剂盒(美国CHEMICON公司);多克隆兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体(美国SantaCruz公司),HRP标记羊抗兔抗体(美国ZYMED公司);蛋白测定试剂盒(上海碧云天公司);eppendorf 7501 SPCR扩增仪、凝胶成像仪(北京天能公司);垂直电泳仪、ECL发光剂(美国GE公司);半干转膜仪、硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad公司);cymentre 2000柯达活体成像仪(美国Kodak公司);Axioplan 2 imaging显微图象分析系统(德国ZEISS公司)。

1.3 实验方法1.3.1 实验动物分组及模型建立

将雌性大鼠按体重随机分为对照、叶酸、柯萨奇病毒B3和柯萨奇病毒B3+叶酸组,每组10只。叶酸及柯萨奇病毒B3+叶酸组灌胃给予叶酸(0.8mg/kg),每天1次,连续2周,对照及柯萨奇病毒B3组灌胃等体积生理盐水;将雌鼠与雄鼠1:1合笼,对照组大鼠自由进水和普通饲料,叶酸及柯萨奇病毒B3+叶酸组大鼠用补充叶酸的饲料喂养;柯萨奇病毒B3及柯萨奇病毒B3+叶酸组大鼠孕第8d腹腔注射100倍半数组织细胞感染量(100TCID50)的柯萨奇B3病毒0.4mL,持续5d。自然分娩后,随机从每组乳鼠中选10只,取心脏,液氮保存备用。

1.3.2 光镜观察心肌细胞损伤

乳鼠心肌组织标本,10%甲醛固定24h,石蜡包埋,4μm切片,苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察。

1.3.3 原位末端标记法(TUNEL)测心肌细胞凋亡

取乳鼠心肌组织固定、石蜡包埋、切片。TUNEL步骤按照试剂盒要求进行,将石蜡切片脱蜡、磷酸盐缓冲液洗片、消除内源性过氧化物酶;加入新鲜配制的TUNEL反应液,树脂封片,Axioplan 2 imaging显微图象分析系统处理。

1.3.4 Western blot法检测凋亡蛋白表达

将心肌组织置于研钵中,使用研钵在液氮中研磨成粉末状,加入蛋白质裂解缓冲液及蛋白酶抑制剂,离心取上清液,按试剂盒测定蛋白质含量。聚丙烯酰胺凝胶电泳后行westernBlot。相应蛋白表达值为条带的灰度值除以β-actin内参校正。

1.3.5 逆转录聚合酶链(RT-PCR)测定凋亡基因mRNA

采用鼠β-actin作为内参,bax、caspase-3、bcl-2引物设计参照GeneBank,确定的序列交上海生工公司合成。Trizol抽提总RNA后去除基因组DNA,用紫外分光光度法测定总RNA纯度和浓度.采用一步法RT-PCR系统做反转录聚合酶链反应。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶(含EB)电泳,溴化乙淀染色,用图像分析仪进行分析。

1.4 统计分析

采用SPSS 13.0统计软件,各组间比较采用多样本均数比较的方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 乳鼠心肌细胞病理变化

接种柯萨奇B3病毒组乳鼠心肌细胞镜下可见细胞坏死、淋巴细胞浸润,部分可见心肌细胞排列紊乱、断裂。心肌内间质增生,心肌纤维断裂部由纤维组织填充。柯萨奇病毒B3+叶酸组心肌细胞坏死减少,心肌纤维断裂得到改善,炎性细胞浸润减少。

2.2 心肌细胞凋亡阳性率

光镜下正常乳鼠心肌细胞核为蓝色,凋亡细胞核为深浅不一的棕褐色颗粒状、固缩状、或碎裂状。柯萨奇病毒B3组乳鼠心肌细胞出现不同程度凋亡。对照组乳鼠心肌细胞未见明显凋亡,柯萨奇病毒B3、柯萨奇病毒B3+叶酸组乳鼠心肌细胞凋亡率高于对照组及叶酸组。

2.3 乳鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达(表 1)
表 1 乳鼠心肌细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平(x ± s，n=10)

柯萨奇病毒B3及柯萨奇病毒B3+叶酸组bax、caspase-3蛋白表达高于对照组和叶酸组(P＜0.05),bcl-2蛋白表达低于对照组(P＜0.01);柯萨奇病毒B3+叶酸组bcl-2蛋白表达高于叶酸组(P＜0.05),bax、caspase-3蛋白表达低于病毒组(P＜0.05)。

2.4 乳鼠心肌细胞凋亡相关基因mRNA表达(表 2)
表 2 乳鼠心肌细胞Bax，Bcl-2，Caspase-3mRNA表达水平(x ± s，n=10)

Bax、Caspase-3在柯萨奇病毒B3、柯萨奇病毒B3+叶酸组、对照组中高于叶酸组(P＜0.05),Bcl-2低于叶酸组(P＜0.05),柯萨奇病毒B3组Bax、Caspase-3mRNA表达高于对照组(P＜0.05),Bcl-2mRNA表达低于对照组;柯萨奇病毒B3+叶酸组Bax、caspase-3mRNA表达低于病毒组(P＜0.05),Bcl-2mRNA表达高于柯萨奇病毒B3组。

3 讨论

维生素是维持机体正常发育和代谢所必须的一类微量有机物质。叶酸属于水溶性B族维生素的一种,叶酸在细胞分裂和生长中具重要作用,它是嘌呤和嘧啶合成的辅助因子,是DNA合成所必需,对于DNA损伤修复非常重要。缺乏叶酸的动物对细菌病毒感染的敏感性增加,抗体产生减少,因此T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能受到损害。Huang等〔3〕提出叶酸作为一种新型抗氧化剂可能对氧化应激所介导的细胞凋亡起保护作用。Cipollone等〔4〕通过动物实验发现,叶酸能使致畸因子诱导的小鼠子代先天性心脏病的风险从81.3%下降到64.8%。细胞凋亡是受基因调控,多步骤的过程,至少包括Bcl-2家族蛋白调控和Caspase激活2方面〔5〕。线粒体途径主要由Bcl-2家族成员所控制,包括2类功能相反的蛋白,抑制和促进二者比值决定细胞是否发生凋亡。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族主要成员,Bcl-2>Bax细胞趋于存活,Bax>Bcl-2则细胞凋亡。实验中柯萨奇病毒B3诱导乳鼠心肌细胞凋亡Bax水平明显提高,Bcl-2水平下降。Caspase是细胞凋亡过程中起中心作用的一组半胱氨酸蛋白酶,其活性是鉴定细胞是否进入凋亡的一个重要标志〔6〕。Caspase-3是Caspase家族最重要的成员,各种诱导因素,最终均需要通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡〔7, 8, 9〕。本实验中感染柯萨奇病毒B3的母鼠其子代Caspase-3较之对照组高表达,发现叶酸对感染柯萨奇病毒B3病毒乳鼠心肌细胞凋亡有抑制作用,感染柯萨奇病毒B3的母鼠其子代心肌细胞损伤明显且心肌凋亡增加,通过口服叶酸心肌细胞凋亡率明显下降,因此叶酸对感染柯萨奇病毒B3的乳鼠心肌细胞损伤有修复作用,其机制可能通过影响Caspase-3、Bcl-2、Bax等基因表达调控心肌细胞凋亡,改善心肌功能。

参考文献
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