志贺菌是一种肠道致病菌,临床上可以引起人畜痢疾,对公共卫生与健康造成了巨大威胁〔1〕。其毒力大质粒在志贺菌致病过程中发挥着极其重要的作用〔2〕。志贺菌毒力大质粒的稳定性与环境温度密切相关,在不同的温度条件下生长时,质粒毒力基因的表达不同〔3〕。2004年许兰菊等〔4〕首次发现志贺菌感染鸡案例,并对该鸡源志贺菌进行了诸多研究,同时发现该鸡源志贺菌的毒力大质粒极易丢失。志贺菌毒力蛋白ipaC基因位于志贺菌毒力大质粒上,PCR扩增该基因阳性可表明毒力大质粒的存在〔5〕。因此,ipaC基因对志贺菌的毒力大质粒丢失与否具有鉴别意义。为了探讨志贺菌毒力大质粒在外界环境中能否在相近病原菌中水平转移,以及转移后其致病性变化,本研究选取鸡源鲍氏志贺菌和人源福氏志贺菌,进行了毒力大质粒水平转移和致病性的观察。现将结果报告如下。
1 材料与方法1.1 材料(1)菌株:鸡源鲍氏志贺菌(河南农业大学家畜传染病室保存),经本实验室通过在刚果红培养基上培养菌落不变红,用PCR方法扩增不出其毒力蛋白基因ipaB、ipaC基因,确认已丢失毒力大质粒;人源福氏志贺菌(河南省人民医院惠赠),通过在刚果红培养基上培养菌落变红,用PCR方法扩增出其毒力蛋白基因ipaB、ipaC基因;(2)实验动物:2日龄麻鸡正常发育幼雏80只(郑州瑞祥孵化场),均为雄性;8周龄健康昆明小白鼠25只(河南省实验动物中心)。(3)试剂:TaqDNA聚合酶、MgCI2dNTP、10×Buffer、Loding、MarkDL2000(大连TaKaRa公司);琼脂糖(西班牙BIOWESTAGAROSE公司);其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 菌株鉴定与增菌培养将上述鸡源鲍氏志贺菌、人源福氏志贺菌分别接种于普通营养平板、刚果红营养平板上(观察菌落颜色),于37℃培养24h;分别挑取单个菌落,进行涂片、染色、镜检;挑取单个目的菌菌落接种于含5%血清溶菌肉汤(LB)液体培养基,经恒温水浴摇床培养14h,用菌落计数法计算细菌浓度。
1.2.2 人源福氏志贺菌灭活与质粒DNA制备在人源福氏志贺菌LB液体培养物中加入0.4%甲醛,37℃灭活24h;取灭活菌液1.5mL移入离心(EP)管中,12000r/min离心2min,弃上清,加三羟甲基氨基甲烷-乙二胺乙酸二钠(TE)混匀,12000r/min离心2min,弃上清,加500μLTE混匀后,在沸水中水浴10min,5000r/min离心2min,取上清做为人源志贺菌质粒DNA(染色体与质粒混合DNA),于-20℃保存备用。同时取灭活菌液和提取的上清液分别涂布全血平板,于37℃培养24h后确定无细菌生长。
1.2.3 质粒转移菌株制备取EP管4支,各加入LB培养基1000μL、血清10μL、鸡源鲍氏志贺菌14h震荡培养物50μL。其中2管中加入甲醛灭活的人源福志贺菌300μL,分别标记为1、2管;另2管分别加入人源福氏志贺菌质粒DNA300μL,分别标记为3、4管。取1、3管于37℃培养24h;2、4管于4℃冰箱放置24h。此实验共重复3次后,将4支EP管菌液分别划线接种于刚果红培养基上,于37℃培养24h,然后挑取红色单个菌落涂片、染色、镜检,并挑取目的菌落接种于营养琼脂平板上,鸡源志贺菌、人源志贺菌原始株同时划线培养作为对照。刚果红培养基上长出红色、中等大小菌落,营养琼脂平板培养上长出无色、半透明、大等大小菌落,判定为毒力大质粒转移阳性株。
1.2.4 ipaC基因扩增(1)引物设计:参照鲍氏志贺菌(Genbank序列号:CP001062)ipaC基因序列设计引物。上游引物:5'-GCGAGGATCCATGGAAATTCAAAACACA-3';下游引物:5'-GAGAGTCGACGTTAAGCTCGAATGTTAC-3';预计扩增产物长度为1113bp。(2)PCR扩增:挑取刚果红培养基上判定为毒力大质粒转移阳性株的红色菌落,接种于LB(含5%血清)液体培养基,于37℃培养16h,按煮沸法提取细菌DNA模板。分别在PCR管中依次加入10×buffer5μL、dNTPs5μL、MgCl24μL、上下游引物各1μL、模板DNA10μL、rTaq酶0.5μL、加超纯水至50μL。瞬时离心后按下列循环参数进行PCR扩增:95℃5min;95℃1min、60℃1min、72℃2min,30个循环;72℃10min,4℃保存。取PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。ipaC基因扩增阳性鉴定为毒力大质粒转移株。同时扩增鸡源鲍氏志贺菌和人源福氏志贺菌ipaC基因作为对照。
1.2.5 实验菌株致病性观察(1)增菌培养与菌液稀释:将毒力大质粒转移株和鸡源鲍氏志贺菌原始株分别接种于全血平板上,于37℃培养16h,用LB+5%血清培养液洗下培养好的菌株,采用菌落计数法分别计算菌液浓度,用LB+5%血清培养液分别调整转移株浓度系列为:103、105、107、109、1011、1013个菌/mL;调整鸡源鲍氏志贺菌株浓度系列为:1010、1011、1014个菌/mL。(2)雏鸡人工感染:雏鸡80只,随机分为8组,每组10只。感染途径采用口服方式,感染剂量均为0.1mL。1~6组为感染组,其中,1~3组感染转移株,感染菌液浓度为,1组:102个菌/mL;2组:106个菌/mL;3组:1010个菌/mL。4~6组感染鸡源鲍氏志贺菌,感染菌液浓度为,4组:109个菌/mL;5组:1010个菌/mL、6组:1013个菌/mL。7组为含5%血清LB培养基对照组,8组为空白对照组。人工感染后连续观察7d,记录各组雏鸡精神状态,食欲,粪便,发病及死亡情况。观察结束时所有试验雏鸡全部剖杀,无菌采集典型病变的肝、脾和肠及内容物。(3)小白鼠人工感染:昆明小白鼠25只,随机分为5组,每组5只,感染途径采用腹腔注射,注射剂量均为0.1mL。A~C组为转移株感染组,感染菌液浓度分别为,A组104个菌/mL;B组108个菌/mL;C组1012个菌/mL。D组为含5%血清LB培养基;E组为空白对照。人工感染后连续观察7d,记录各组小白鼠精神状态,食欲,粪便,发病及死亡情况;死亡小白鼠随时放入-20℃保存。观察结束时将所有存活试验小白鼠全部剖杀,连同死亡小鼠一并无菌采集典型病变的肝、脾和肠及内容物。
1.2.6 感染后转移株分离与鉴定将上述无菌采集的雏鸡和小白鼠肝脏、脾脏和肠及内容物,接种于刚果红培养基,37℃培养24h后,分离纯化目的菌株,进行涂片、染色、镜检;同时将小白鼠分离株进行PCR鉴定,方法同1.2.4。
2 结果2.1 不同菌株菌落比较(图 1~4)![]() | 图 1 普通营养琼脂平板上鸡鲍氏志贺菌菌落 |
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注: 红色菌落为毒力大质粒转移成功的转移株; 无色的为鸡源鲍氏志贺菌。 图 2 鸡源株与人源株质粒DNA在刚果红平板上的菌落 |
![]() | 图 3 普通营养琼脂平板上人源福氏志贺菌菌落 |
![]() | 图 4 刚果红营养平板上人源福氏志贺菌菌落 |
丢失毒力大质粒的鸡源鲍氏志贺菌在营养琼脂平板上长出圆形、微凸、无色、半透明、边缘不整齐的中等大小菌落(图 1);在刚果红营养平板上为圆形、微凸、无色、半透明、边缘不整、中等大小的菌落;毒力大质粒转移株则出现红色,表面光滑,边缘整齐的中等大小菌落(图 2)。含毒力大质粒的人源福氏志贺菌在普通营养琼脂平板上长出无色、表面光滑、边缘整齐的小菌落(图 3);在刚果红营养平板上为红色、圆形、微凸、光滑湿润半透明、边缘整齐、中等大小菌落(图 4)。鸡源鲍氏志贺菌、人源福氏志贺菌和转移株经革兰染色后在显微镜下均呈两端钝圆,散在排列的短小杆菌。
2.2 ipaC基因PCR扩增产物比较(图 5)![]() |
注: M: marker DL 2000; 1~3: C、B、A 组小鼠分离株; 4: 鸡鲍氏志贺菌; 5: 人福氏志贺菌; 6: 感染前转移株。 图 5 毒力大质粒转移菌株感染小白鼠分离株与鸡源株、人源株ipaC基因PCR扩增产物 |
除鸡源鲍氏志贺菌外,人源福氏志贺菌、感染前毒力大质粒转移株以及感染转移株小白鼠的分离株均扩增到1113bp大小的目的片断,表明志贺菌毒力大质粒体外水平转移成功。
2.3 致病性比较(1)雏鸡人工感染:人工感染转移菌株和鸡源鲍氏志贺菌24h后,1~3组和6组雏鸡均开始发病,表现精神沉郁,有挤堆、伏卧现象,食欲消退;个别雏鸡有红色血便。发病高峰集中在第4d,7d共发病20只,其中感染转移株的3个组发病16只,占80%。7d内无雏鸡死亡;培养基对照组和空白对照组雏鸡7d内均表现正常。剖检结果显示,所有试验雏鸡均有不同程度病变出现,剖检病变率达100%。病变主要为皮下黄染,肝脏变性、黄染,胰脏肿大,个别胰腺出血,肠道黄染、充气、出血,盲肠肿胀积液、充气、积便(红色),十二指肠水肿、出血,胆囊充盈肿胀。其中第3组病变最严重,第4组病变相对较轻;培养基对照组和空白对照组雏鸡剖检后无明显肉眼病变。(2)小白鼠人工感染:感染后第2天,各组小白鼠均有挤堆现象,B组和C组小鼠出现食欲减少,饮水减少;部分小鼠精神不振,个别出现腹泻症状(C组)。第4天各族小鼠开始转归正常;7d内明显出现发病症状4只(B组1只,C组3只);各组小鼠均无死亡;培养基对照组和空白对照组小鼠7d内均正常。剖检结果显示,所有试验组小白鼠均有不同程度病变出现,剖检病变率达100%。病变主要为皮下出血点,肝脏瘀血、肿大易碎,脾脏瘀血易碎,肠道出血、肠壁极薄,肾瘀血、胃黏膜有出血点,肺出血。A组肉眼病变较轻,C组最严重;培养基对照组和空白对照组小白鼠无明显肉眼病变。
2.4 感染后分离株回收与鉴定将各组雏鸡和小白鼠剖检典型病料接种于刚果红培养基,培养结果可见,感染转移株的1~3组雏鸡分离株和小白鼠分离株均有红色中等大小菌落出现;感染鸡源鲍氏志贺菌的4~6组雏鸡分离株则长出无色中等大小菌落;镜检可见,各分离株均呈两端钝圆、散在排列的革兰阴性小杆菌;小白鼠分离株ipaC基因PCR扩增产物与图 5相符。毒力大质粒转移株的分离株菌落、菌体特征及PCR扩增产物均与制备株相同,表明志贺菌毒力大质粒体外水平转移后培养特性基本不变,且具有一定的稳定性。
3 讨论本研究成功制备了志贺菌毒力大质粒体外水平转移菌株,文献记载表明,志贺菌在营养琼脂上生长不良,因其毒力大质粒能与刚果红结合,所以含有毒力大质粒的志贺菌能在刚果红营养平板上长出红色菌落〔6〕。本研究结果显示,丢失毒力大质粒的鸡源鲍氏志贺菌在普通营养琼脂平板上和在刚果红营养平板上均生长良好,含有毒力大质粒的人源福氏志贺菌和转移株在普通营养琼脂平板上均为生长不良的小菌落,在刚果红营养琼脂上则生长良好,菌落为红色。提示志贺菌在丢失毒力大质粒后其培养特性发生了较大改变,而重新获得毒力大质粒,则可恢复其大部分培养特性。
研究表明,毒力大质粒的不稳定性与环境温度密切相关〔7〕。本研究结果也显示,灭活的人源福氏志贺菌与鸡源鲍氏志贺菌间没有进行毒力大质粒转移,人源福氏志贺菌质粒DNA与鸡源鲍氏志贺菌也只在适当的外界条件下才发生毒力大质粒转移,提示灭活的志贺菌全菌无法进行毒力大质粒体外转移,只有当毒力大质粒裸露出来,且具有适宜条件时,才可能在体外转移到相近菌体中。体外和体内环境存在着巨大差异,因此,志贺菌毒力大质粒能否在体内与相近病原菌发生水平转移有待深入研究。
人工感染试验结果显示,感染雏鸡的鸡源鲍氏志贺菌剂量远远大于转移菌株剂量,但感染转移菌株雏鸡的发病率明显增加,表明志贺菌的致病性与其毒力大质粒有关。同时,转移菌株人工感染后,雏鸡和小白鼠虽有发病,但未引起死亡,表明该转移菌株致病性不强,特别是对小白鼠的致病性明显不强。可能与小鼠日龄较大,对志贺菌有较强抵抗力有关;也可能由于人源福氏志贺菌的毒力大质粒的受体菌为鸡源鲍氏志贺菌,菌型不同,从而导致两者结合后对动物机体的致病性有所下降。转移菌株不仅能使雏鸡和小白鼠感染发病,而且能在雏鸡及小白鼠体内大量繁殖,表明人源福氏志贺菌的毒力大质粒转移到鸡鲍氏志贺菌后虽然致病性有所降低,但仍具有一定致病性,而且具有一定稳定性,若其他动物接触到该菌仍有可能会造成感染。
本研究不仅对志贺菌毒力大质粒的致病性及其机理有所揭示,而且也为对其更进一步的研究奠定了基础。本研究结果提示,志贺氏菌在适宜的外界环境中只要有毒力大质粒和丢失毒力大质粒的相近病原菌存在,两者会发生质粒转移,重新组成新的完整的致病菌株,这也为在一定程度上预测将来可能出现的新病原菌提供了参考依据。
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〔6〕 | 陆德源.医学微生物学[M].5版.北京:人民卫生出版社,2001: 119-123. |
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