氟骨症的病理表现复杂多样，主要是骨形成和骨吸收平衡破坏，骨转换加速^〔1〕。成骨细胞功能活跃，在氟骨症病变中是一个发生较早、并起主导作用的环节。OSX是最近由Nakashima等^〔2〕发现的成骨细胞特异性转录因子，只在发育的骨组织中特异性表达，是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的转录因子^〔3〕。它在氟骨症的发生发展中的作用尚不清楚。本研究通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法对饮水型慢性氟中毒大鼠骨组织中的OSX基因及蛋白表达进行检测，探讨OSX在氟骨症发病机制中的作用，为地方性氟中毒的防治提供参考。

OSX兔抗大鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、SP9000免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺显色(DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);Biomias2000彩色图像分析仪系统(四川大学图像图形研究所)。

清洁级SD大鼠[四川大学动物实验中心，动物许可证号SCXK(川)-2006-10]36只，雌雄各半，体重100～120g，适应性饲养1周后，按性别和体重随机分为3组，每组12只，组内雌雄各半，对照组，自由饮用自来水(氟含量＜1mg/L);低氟组，自由饮用含氟5mg/L自来水;高氟组，自由饮用含氟50mg/L自来水。各组大鼠喂饲全营养颗粒大鼠饲料。6个月后，收集大鼠24h尿样，股动脉放血处死大鼠，进行有关检测。

骨标本先碳化、灰化后再采用氟电极法测定。

石蜡切片，苏木素伊红染色(hematoxylin-eosinstain，HEstain)，应用彩色图像分析仪测量股骨下段骺板下1mm处的骨皮质厚度、骨小梁宽度、骨髓腔宽度、骨小梁百分比，每组每项指标随机选择5个视野，测定5个数值，取平均值，并进行统计学处理。

免疫组织化学(SP)法测定大鼠股骨下段骨中OSX蛋白表达，同时用磷酸盐缓冲液作为阴性对照，细胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性表达。计数每张切片5个视野的成骨细胞阳性细胞数，然后算出每张切片的成骨细胞平均阳性细胞数。

大鼠经股动脉放血处死，取一侧股骨迅速置于液氮中保存。Trizol法提取大鼠股骨下段总RNA，在DU60核酸蛋白分析仪上测量RNA样品的含量，选取A260/A280比值为1.9～2.1的样品进行反转录。引物设计和合成:通过Oligo6.0引物设计软件，设计引物序列。OSXmRNA引物上游:5'-CTATGCCAATGACTACCCACCC-3'，下游:5'-CTGCCCACCACCTAACCAA-3'。参照物β-actin上游:5'-CCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，下游:5'-GGAAGAGGATGCGGCAGTG-3'。实时荧光定量PCR，按照QuantSYBRGreenPCRkit说明，real-timePCR反应体系为:cDNA模板2μL，2.5×RealMasterMix/20×SYBRsolution10μL，ddH₂O6.4μL，引物上、下游(10mmol/L)各0.8μL，总体积为20μL。反应条件为:50℃120s，95℃600s，95℃15s，60℃60s，共40个循环。同时做65～95℃溶解曲线。

采用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，每组所得结果用±s表示，P＜0.05差异有统计学意义。

表 1

表 1 各组大鼠尿氟、骨氟含量比较(±s，n = 12)

表 1 各组大鼠尿氟、骨氟含量比较(±s，n = 12)

染氟组大鼠尿氟含量较对照组明显升高，各组间尿氟含量差异均有统计学意义(P＜0.05，F=100.25);与对照组比较，各染氟组大鼠的骨氟含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05，F=111.81)。

表 2

表 2 各组大鼠股骨形态计量学检查结果(±s，n = 12)

表 2 各组大鼠股骨形态计量学检查结果(±s，n = 12)

低倍镜下可见，对照组大鼠股骨远端骺板静止层和增生层的软骨细胞排列整齐，骨小梁粗细均匀、数目适中。染氟组大鼠股骨远端骺板增生活跃，骨小梁数目增多，排列紧密，骨髓腔变窄，表现为骨质硬化。

图 1

注:A 为对照组，B 为低氟组，C 为高氟组。图 1 慢性氟中毒大鼠股骨远端OSX 表达(SP 法，× 400)

对照组免疫组化反应阳性产物染色较淡，成骨细胞稀少;染氟组阳性产物呈棕褐色，染色较深，成骨细胞数量显著增多。高氟组OSX阳性成骨细胞数增多[(51.47±3.37)个]，明显高于低氟组[(36.80±2.83)个]和对照组[(27.00±2.92)个]，差异有统计学意义(P＜0.05，F=199.52);高氟组OSX阳性成骨细胞数与对照组相比有所增多，但差异无统计学意义。

变化染氟组OSXmRNA表达量增加，低氟组为对照组的(2.10±0.09)倍，高氟组为对照组的(2.82±0.13)倍，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05，F=175.96)。

有研究证明，P物质(substanceP)可通过OSX表达促进成骨细胞分化及骨形成^〔4〕。骨形态发生蛋白(BMP)2通过Smad途径、Dlx5上调OSX表达^{〔5, 6〕}。OSX表达也受丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MAPK)途径和蛋白激酶D途径的调控^〔7〕。张亚楼等^〔8〕的最新研究证实，氟可影响体外培养的成骨细胞OSXmRNA表达，呈现低剂量促进表达，高剂量下调表达的双向趋势。但OSX是否参与活体的氟骨症发病尚不清楚。

本实验中，随染氟剂量的增加，各染氟组OSX表达水平明显升高，提示氟可能是通过上调OSX的表达来促进骨髓间质干细胞向成骨细胞分化。本实验结果与前人的研究结果一致。因此，本实验结果证明，5mg/L的染氟剂量足以促进OB分化成熟，而50mg/L的染氟剂量对OB的促分化能力更加明显，这种现象证明长期小计量氟可促进骨形成;OSX蛋白参与过量氟对成骨细胞的促增殖和分化作用，是氟中毒时氟骨症发生的机制之一。那么，过量氟是通过哪些信号通路对OSX进行调控，成为研究关注的问题。