蜡样芽胞杆菌是引起细菌性食物中毒最常见的一种条件致病菌。中国检验标准目前仍以细菌计数≥105个/mL才能定其为致病菌^〔1〕。每次食物中毒的病因不同，很难对所有样品均进行计数。因此，对蜡样芽胞杆菌进行快速鉴定和分型十分重要。如果从各类标本中分离的菌株为同一型，就可确定为致病菌，反之则可排除。目前，蜡样芽胞杆菌分型仍以传统生化分型为主，但所需时间长，结果不稳定，重现性差，而且有些菌株不能分型^〔2〕。有文献报道，vrrA基因是炭疽芽胞杆菌的一个多态性位点^{〔3, 4〕}。本研究采用vrrA基因PCR扩增技术研究蜡样芽胞杆菌的DNA多态性，拟建立一种快速分子分型方法，用于食物中毒的快速溯源。

营养肉汤培养基、甘露醇卵黄多粘菌素培养基(北京陆桥公司);血琼脂平板(广州迪景生物工程公司);蜡样芽胞杆菌生化鉴定盒、葡萄糖磷酸盐胨水、LUGOL碘液(广东环凯微生物科技有限公司);PCR缓冲液、加样缓冲液、MgCl2、dNTP、rTaq酶、胶块染色剂、100bpDNA分子量标准等(大连宝生物工程有限公司)。9700PCR仪(美国PE公司);凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

根据GenBank上的蜡样芽胞杆菌vrrA基因序列，自行设计一段引物，序列为上游5'-CACAACTACCACCAATGGCACA-3';下游5'-GCGCGTTTCATTTGATTCA-TAC-3'。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

从2000-2009年各食物中度暴发和散发病例的临床分离株中挑选有代表性的蜡样芽胞杆菌菌株47株，其中9株为散发病例分离株，38株为6起食物中毒暴发中分离的菌株;以检定所购买的标准菌株NCTC75097为阳性对照株。

菌株从-20℃菌种保存冰箱里取出，接种至血平板和甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基，置于37℃电热恒温培养箱24h(过夜)培养，观察平板上菌落生长状况，挑选菌落作革兰染色镜检并同时接种营养肉汤中，置37℃恒温摇床内培养24h(过夜)备用。

参照中华人民共和国标准GB/T4789.14-2003^〔5〕进行。

参见文献〔4〕。

测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司进行。从GenBank下载编号为E33L、ATCC14579和ATCC10987的vrrA基因序列进行辅助比对，测序结果用BioEdit和MEGA分析软件进行同源性分析比较，得到分子进化树，并根据进化树对47株蜡样芽胞杆菌进行分子分型。

菌株在血平板和甘露醇卵黄多粘菌数琼脂平板(MYP)上均生长良好。菌落特征明显:表面粗糙蜡样，不透明，似毛玻璃状，菌落较大，血平板上呈β溶血。菌株在肉汤里呈混浊生长，为革兰阳性芽孢杆菌。

47株蜡样芽胞杆菌中有5株菌不能分型，其余42株菌可分为2型、10型和4型。其中2型16株，占34.04%;10型16株，占34.04%;4型10株，占21.28%;未鉴定出型别的为5株，占10.64%。

47株蜡样芽胞杆菌经vrrA基因PCR扩增，均扩增出300bp左右的DNA扩增产物，经测序结果证实为280～290bp。其部分扩增电泳图片见图 1。

图 1

注:M: 100 bp marker; 1 ～ 9: 蜡样芽胞杆菌分离株; 10: 阳性对照( NCTC75097) ; 11: 阴性对照( 大肠杆菌) 、12 号为空白对照( 无菌水) 。图 1 部分蜡样芽胞杆菌PCR 扩增产物凝胶电泳图

可分为13个型，分别编码为MT1-MT13。其中MT13型19株，占40.43%;MT1型8株，占17.02%;MT10型4株，占8.51%;MT2、MT4、MT5、MT6、MT7、MT8型均为2株，分别占4.26%;MT3、MT9、MT11、MT12型均为1株，分别占2.13%。其中2009年的1起食物中毒暴发中分离的8株蜡样芽胞杆菌菌株分子分型均为MT13型。

采用传统生化分型方法，47株蜡样芽胞杆菌中42株可分为2型、4型、10型，5株不能分型;采用分子分型方法，47株菌株可分为13个型，其中生化分型2型的菌株应用分子分型可分成MT1、MT2、MT3、MT4、MT6、MT7、MT8、MT13，生化分型10型的菌株用分子分型可分为MT5、MT9、MT13，生化分型4型菌株用分子分型可分为MT1、MT11、MT12)，生化分型没有鉴定出型别的5株菌用分子分型可分为MT5、MT10、MT12。MT13型的19株菌中出现了生化4型、2型和10型，主要以生化10型居多，占84.21%。结果表明，2种分型方法分型基本一致，生化型不同的，分子分型大多也不同;而生化分型相同的，分子分型能分得更加精细和准确。

目前，蜡样芽胞杆菌食物中毒溯源仍以传统生化分型为主。根据硝酸盐还原、明胶液化、柠檬酸盐利用、伏-普二氏(Voges-Proskauer，V-P)试验和淀粉水解试验把蜡样芽胞杆菌分为15个生化型^{〔6, 7, 8〕}。本研究通过平行对照实验发现，生化分型的结果重现率只有80%～90%。另外，生化反应所需试剂繁多，操作费时费力，标准较难控制，实验过程中因环境或人为因素出现误差的机会较大。本研究在国外研究炭疽芽胞杆菌多态性和DNA指纹图谱的基础上，根据蜡样芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌属于芽胞杆菌属的特点，应用vrrA基因为分子遗传标记，研究蜡样芽胞杆菌的多态性，建立一种分子分型方法，替代传统生化分型。生化分型与分子分型比较结果表明，分子分型比较精细。如本研究中所选的16株菌生化分型同为2型，分子分型却可分为8个不同型，证明分子分型可更准确地对菌株进行分型。本研究发现，2009年的1起食物中毒暴发中分离的8株蜡样芽胞杆菌菌株分子分型型别均一致，证明该起食物中毒暴发是由蜡样芽胞杆菌引起。因此，分子分型结果可为食物中毒病原学的确诊提供更准确的依据，但其方法有待进一步完善。