石英粉尘是中国最主要的职业危害因素之一，可致矽肺，也可致癌。以往研究表明，DNA可以通过氢键与石英表面的SiO·自由基结合，形成DNA-石英复合物进而影响DNA复制、修复和基因表达，并干扰纺锤体的形成和染色体的分离，最终导致基因突变以及肿瘤形成^{〔1, 2, 3〕}。近期研究表明，石英可引起DNA的损伤^{〔4, 5〕}。DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSBs)是DNA损伤中最严重的一种。本研究拟联合应用rH2AX磷酸化(rH2AX)免疫荧光技术、中性彗星实验以及微核实验观察石英致DNA及染色体损伤的作用，从细胞分子水平上探讨矽肺的致病机制。

CO₂孵箱(加拿大Ravco公司)、6孔培养板(美国Corning Costar公司)、电泳仪(美国Bio Rad公司)、Cytospn 4涂片机(美国Thermo Scientific公司)、NIKON E400荧光显微镜。

人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblast，HELF)(中国医学科学院基础所细胞室)。标准的α石英粉尘(中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所)，经玛瑙研钵研磨后尘粒直径≤5μm的＞95%。H2AXSer139磷酸化抗体(美国Upstate Biotechnology公司)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物公司)。

参照文献〔6〕，相应调整加入抗体。选择合适的滤光片进行观察，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记:495nm，Image-ProPlus 6.0软件进行半定量分析。

按实验设计处理细胞，1000g离心收集细胞，调浓度至1×10⁶/L。中性单细胞凝胶电泳试验参照文献〔7〕。胶片经溴化乙锭(ethidium bromide，EB)染色后荧光显微镜下观察并拍摄照片，结果判定，首先由目测初步判定，然后使用国产单细胞凝胶电泳分析软件IMI1.0^〔8〕，以Olive矩来表示DSBs损伤程度。

按实验设计处理细胞，同时设双氧水阳性对照组(50μmol/L)(预试验表明对照组的作用浓度对细胞活力没有显著影响)。去除培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清冼。加入新鲜的含10%小牛血清的培养基，加入松胞素B(终浓度为3μg/mL)继续培养1.5个细胞周期(HELF:32h)。作用结束，PBS清冼，消化，涂片机甩片(300g，1min)，干燥10min，固定10min。将玻片置于室温下自然干燥过夜。10%吉姆萨氏染液染色10min，于10×100倍光镜下，计数1000个双核细胞中的微核细胞数。

采用SPSS 14.0统计软件对数据进行方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图 1

注:不同剂量的石英刺激HELF 细胞12 h，γH2AX 焦点形成情况，图中绿色( FITC 标记) 标记γH2AX，比例尺: 100 μm。图 1 不同剂量石英诱导的γH2AX 焦点形成情况

阴性对照组不加一抗，直接滴加二抗，呈阴性反应，灰度值为33.3±17.1)。说明实验系统无明显误差，为特异性染色。100μg/mL石英刺激HELF细胞12h，γH2AX磷酸化焦点水平增高，与无石英刺激组比较，差异有统计学意义。随着石英剂量增加到200、400μg/mL，γH2AX磷酸化焦点水平增高更加明显，提示石英与DNA双链断裂存在剂量效应关系。

表 1

表 1 不同剂量石英刺激HELF 细胞DSBs损伤程度及微核率(±s)

表 1 不同剂量石英刺激HELF 细胞DSBs损伤程度及微核率(±s)

图 2

注:比例尺: 100 μm。图 2 不同剂量石英刺激HELF 细胞12h 中性彗星电泳图

将Olive矩作为DSBs损伤程度的指标，结果显示石英刺激可引起DSBs损伤程度增高，且与石英存在剂量效应关系。

双氧水阳性对照组的微核细胞率为16‰，明显高于空白对照组。不同剂量石英刺激后，微核细胞率均稍有增加，但与空白对照组比较，差异均无统计学意义。

粉尘中的游离SiO₂(石英为代表)含量越高，致肺组织纤维化的能力越强。陈朝东等^〔9〕的研究发现，宝石加工厂的游离SiO₂含量平均为92.79%，工人矽肺发病率高，工龄短，肺功能损害严重。1997年国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer，IARC)宣布将石英升级为人类致癌物^〔10〕。细胞无度增殖是癌症的基本特征，成纤维细胞的大量增殖则是纤维化的必然现象，细胞的异常增值与基因组的不稳定性有关。

Rogakou等于1998年首先发现电离辐射处理后，H2AX的SQE结构域中的139位点Ser残基迅速被磷酸化，并且在DSBs处形成焦点^〔11〕。本研究中，免疫荧光法与彗星实验的结果一致，均表明石英可引起DSBs，且100μg/mL剂量组H2AX的水平增高且差异有统计学意义，说明rH2AX免疫荧光法的灵敏度高于传统的彗星实验。

H2AX可作为遗传毒性检测的标志物，对博来霉素等遗传毒物刺激产生阳性反应，呈剂量-反应关系，与彗星实验、微核实验结果一致^〔12〕。微核实验的遗传学终点是观察染色体或有丝分裂器的损伤，DSBs修复不完全将会导致基因组不稳定性增加。但在相同实验条件下，微核率的变化与免疫荧光法及彗星实验结果并不一致，对此尚需进一步的研究。

损伤的DNA未被修复或修复不正确，将导致基因突变或染色体畸变，细胞死亡/凋亡，或发展为癌细胞^〔13〕。对石英致DNA损伤机制的研究可为尘肺病的早期筛查、诊断及治疗提供理论依据。