中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (8): 982-984   PDF    
引用本文
吕刚, 芦亚君, 范志刚, 史大中, 甘秀凤, 钟赛凤. 欧猥迭宫绦虫乳酸脱氢酶新基因识别及其结构与功能预测[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(8): 982-984.
LÜ Gang, LU Ya-jun, FAN Zhi-gang, et al. Identification of a novel gene encoding lactate dehydrogenase from Spirometra erinaceieuropaei and prediction for its structure and function[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(8): 982-984.
欧猥迭宫绦虫乳酸脱氢酶新基因识别及其结构与功能预测
吕刚, 芦亚君, 范志刚, 史大中, 甘秀凤, 钟赛凤    
海南医学院寄生虫学教研室, 海南海口571101
收稿日期: 2010-02-15.
基金项目: 国家自然科学基金(30860070);海南省教育厅科研课题(HjKj200570)
作者简介: 吕刚(1963- ),浙江永康人,教授,博士,研究方向:分子寄生虫学
摘要: 目的 用生物信息学方法识别欧猥迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei,S.e)乳酸脱氢酶(LDH)全长cD-NA序列,预测其编码蛋白的结构与功能。方法 用NCBI、EMBI、Expasy等在线网站对序列结构域、功能域等进行分析以识别基因,预测其蛋白序列理化参数、信号肽、抗原表位、拓扑结构等,三级结构同源建模应用Vector软件进行同源序列比对、构建进化树及三级结构模型分析。结果 目标序列具有完整开放阅读框、L-LDH结构域及功能域、polyA,确定为LDH全长cDNA,命名为SeLDH(GU 121 968);该序列编码338氨基酸残基(aa),预测等电点为6.38,分子量为36 028.6Da;与华支睾吸虫、日本血吸虫及人LDH的相似性分别为60%、59%及55%;有5个可能跨膜区域;主要线性表位中的185～191 aa、223～235 aa及328～338 aa与人LDH相同区域差异明显;表位104～111 aa与人LDH相同区域有1 aa的差异,其上有NAD及底物结合位点,关键催化位点112 R紧邻该区域;三级结构模型显示其在蛋白表面形成环状结构,3个关键催化位点及NAD、丙酮酸结合位点在该环状结构上或周围形成催化中心。结论 获得SeLDH全长cDNA序列;该蛋白可能是膜蛋白;是理想的免疫诊断、药物作用及疫苗靶分子。
关键词: 欧猥迭宫绦虫     乳酸脱氢酶     结构     功能     预测    
Identification of a novel gene encoding lactate dehydrogenase from Spirometra erinaceieuropaei and prediction for its structure and function
LÜ Gang, LU Ya-jun, FAN Zhi-gang, et al     
Department of Parasitology, Hainan Medical College, Haikou 571101, China
Abstract: To identify the full length cDNA sequence encoding lactate dehydrogenase(LDH)from adult Spirometra erinaceieuropaei(S.e.)and to predict the structure and function of the protein. Methods Some online websites such as NCBI,EMBI,Expasy and a softw are packages Vector NTI were exploited to analyze the sequence bioinformatics, including the open reading frame(ORF),conserved structure and functional domain,multi-sequence homological alignment, phylogenetic analysis,topological prediction,homology modeling of tertiary structure,and antigenic epitope analysis. Results The target sequence had a full ORF,typical L-LDH structure domain,full conserved domain and polyA.It was confirmed as a full length cDNA encoding LDH of S.e.and then named as SeLDH(GU121968).The sequence encodes a protein of 338 amino acids with the predicted molecular weight of 36 028.6Da and isoelectric point of 6.38.Compared with the LDHs of Clonorchis sinensis,Schistosoma japonicum and human,the similarity of SeLDH is 60%,59%,and 55%,respectively.In the protein,5 transmembrane regions were found and 185-191aa,223-235aa,328-338aa of the 5 major epitopes were presented with significant difference compared to the same region of human LDH.There is only 1aa difference between epitope 104-111aa of SeLDH and that of human,which is an important function region containing 2 NAD binding sites and 1 substrate binding site and the key catalytic residue 112R is close to the region.Tertiary structure demonstrates that 104-111aa is on the surface of the protein and forms a substrate binding loop,three key catalytic sites and NAD,pyruvate binding sites formed a catalytic center near the loop. Conclusion The full length cDNA sequence of a novel gene SeLDH was obtained.The bioinformatics implies that SeLDH might be a transmembrane protein and an ideal molecule for immunodiagnosis,vaccine and drug reaction.
Key words: Spirometra erinaceieuropaei     lactate dehydrogenase     structure     function     prediction    

欧猥迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei，S.e)又名曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni，S.m)，是我国及东亚、东南亚国家及地区较为常见的人兽共患寄生虫，其幼虫裂头蚴(plerocercoid)可寄生人体引起裂头蚴病(plerocercoidosis)，成虫偶可寄生人体〔1〕。由于成虫寄生于宿主小肠无氧环境，其能量主要依赖于无氧糖酵解，乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)是糖酵解途径的末端酶，在寄生虫能量代谢中起着重要作用。

本研究在构建S.e成虫全长cDNA文库、大规模5’端表达序列标签(expressed sequence tag，EST)测序的基础上，发现编号GDTC009-C10克隆的797bpEST序列与华支睾吸虫LDH(CsLDH)同源性最高为60%，随即延长测序，经拼接后获得一全长cDNA序列用生物信息学方法对该序列进行识别、鉴定，并对其编码蛋白结构和功能进行预测，以期为其功能研究提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材 料

欧猥迭宫绦虫成虫全长cDNA质粒文库构建、大规模EST测序、Blastn、Blastx、unigene归并由本课题组与上海联合基因公司合作完成。目标基因的质粒编号为GDTC009-C10。其他寄生虫(日本血吸虫、华支睾吸虫、恶性疟原虫)及模式生物(秀丽杆线虫、果蝇、斑马鱼、非洲爪蛙、原鸡、家鼠及人)LDH氨基酸序列源自GenBank(序列号略)。

1.2 实验方法

参照文献〔2〕方法进行。

2 结 果 2.1 基因的识别、鉴定(图 1)
图 1 推测SeLDH 氨基酸序列

所获cDNA序列由1233个核苷酸组成，最大编码序列为1016bp，编码338氨基酸残基(aa)，polyA位于1178～1195bp，推测的氨基酸序列见图 1，结构域及功能域预测该序列具有典型的L-LDH结构域、完整的L-LDH-NAD保守功能域及L-LDH功能基序IGEHGDS(196～202aa)，由此证明克隆GDTC009_C10的插入序列为LDH全长cDNA，命名为SeLDH，GenBank登录号为GU121968。

2.2 同源基因多序列比对、同源性及分子进化分析

多序列同源比对，所有物种具有多个共同保守位点，SeLDH关键酶催化位点高度保守，分别位于112(R)、172(D)及(199H)。SeLDH与同为扁平动物门的CsLDH、SjLDH同源性最高，分别为60%和59%，与PfLDH同源性最低为26%;与其他物种的同源性在53%～56%，例如与HsLDH的同源性为55%。分子进化分析显示SeLDH与同门的SjLDH及CsLDH源于同一祖先，其进化地位较原虫高，与线虫、果蝇的进化关系较近，与脊椎动物进化关系最远。

2.3 理化参数、信号肽、亚细胞定位预测

SeLDH预测等电点(PI)为6.38，分子量为36028.6Da，280nm水溶液中的消光系数为35450单位/M/cm，在哺乳动物、酵母及大肠埃希菌中的半衰期分别为30、＞20、＞10h小时，不稳定系数为24.62，属于稳定蛋白。发现疑似信号肽序列，酶切位点位于18aa－19aa处，无线粒体、核、过氧化物酶体等的靶向信号，预测为细胞质内蛋白的可信度为94.1%，定位于内质网、线粒体、核的可能性分别为55.6%、33.3%、11.1%。

2.4 亲水性及B细胞线性表位预测

亲水性和B细胞线性表位预测结果基本相同，可能的抗原表位位于104～111aa、185～191aa、198～202aa、222～235aa、328～338aa，其中185～191aa、222～235aa、328～338aa与HsLDH以及SjLDH、CsLDH相同区域差异显著，可能是较为理想的特异性诊断抗原表位。

2.5 蛋白质拓扑结构分析、NAD及底物结合位点、翻译后修饰位点预测(图 2)
注: 粗体字－ 关键催化位点; 双下划线－ 抗原表位; T － 跨膜区; i － 膜内; o － 膜外; # － NAD 结合位点; * － 丙酮酸结合位点。图 2 SeLDH 氨基酸序列的拓扑分析

SeLDH拓扑结构预测结果如图 2所示。该蛋白具有五个可能的跨膜区域，推测可能是膜蛋白，N端在膜内，C端在膜外。预测共有14个NAD结合位点及6个底物丙酮酸结合位点，NAD及底物结合位点主要集中在三个关键催化位点112(R)、172(D)及199(H)周围。该蛋白有1个N－糖基化位点，4个蛋白激酶C磷酸化位点，3个酪蛋白激酶II磷酸化位点，6个N－豆蔻酰化位点，1个原核细胞膜脂蛋白脂质附着位点，1个L－乳酸脱氢酶活性位点。

2.6 三级结构同源建模及分析(图 3)

注:显示104aa － 111aa 区域、关键催化位点、NAD( #) 及丙酮酸( * ) 结合位点图 3 SeLDH 三级结构模型
表位104～111aa在蛋白表面形成一环状结构，关键催化位点112R、172D及199H构成一个催化中心，与该环状结构附近相连，部分NAD及底物丙酮酸结合位点位于该环上，其他结合位点在该区域周围。

3 讨 论

目前GenBank中尚无假叶目绦虫LDH全长cDNA序列的记录，本研究从S.e.成虫cDNA全长文库中筛得SeLDH全长cDNA，对SeLDH的识别及对其结构与功能的预测，为研究其与圆叶目绦虫及其他寄生虫LDH差异，指导后期功能研究及应用研究奠定了基础。

SeLDH预测等电点(PI)为6.38，分子量为36028.6Da，对SeLDH的信号肽、跨膜结构及拓扑结构分析结果显示该蛋白具有信号肽及5个可能的跨膜区域，具有膜蛋白的特性，推测其可能是跨膜蛋白或膜相关蛋白。

对SeLDH亲水性分析及B细胞线性表位分析结果表明，该序列具有5个可能的抗原表位，其中表位185aa～191aa、222aa～235aa、328aa～338aa与宿主HsLDH及同门的SjLDH、CsLDH相同区域差异较大，可能是理想的特异性诊断抗原表位。表位104aa～111aa尽管与宿主LDH相同区域相似性较高(87.50%)，但该表位恰是NAD及底物丙酮酸结合区之一;构建的三级结构模型显示该表位位于蛋白表面，关键催化位点112R与172D及199H构成的催化中心紧邻该表位，部分NAD及底物丙酮酸结合位点位于该区域上，其他结合位点均集中于该区域周围，提示相应抗体与其结合不仅能介导免疫攻击，而且还有酶特异性抑制剂作用，阻止底物丙酮酸的结合，使丙酮酸在细胞内积聚致使虫体死亡，可视为高特异性的药物分子;针对该位点的化合物如NAD及丙酮酸类似物也可起到阻断酶活性的作用，从而达到杀虫的目的，因此该表位是理想的疫苗、药物作用位点，可用于抗虫新药的筛选。对疟原虫、弓形虫的新药研究也主要集中于该区域〔3,4,5〕。另外，吡喹酮(praziquantel，PZQ)作为一种重要的抗寄生虫药物，对扁形动物门的吸虫、绦虫均有良好的杀虫效果，但其分子作用机制目前尚未完全明了，作者等在对SjLDH研究时发现PZQ对重组SjLDH的活性有显著抑制作用，提示LDH可能是PZQ的分子作用靶标之一〔6〕，是否作用于该区域，值得进一步研究。

参考文献
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〔6〕 吕刚,胡旭初,黄灿,等.棉子酚、吡喹酮及蒿甲醚对重组日本血吸虫乳酸脱氢酶作用的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2007,25(5):401-405.
欧猥迭宫绦虫乳酸脱氢酶新基因识别及其结构与功能预测
吕刚, 芦亚君, 范志刚, 史大中, 甘秀凤, 钟赛凤