中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (8): 975-977   PDF    
引用本文
王宜庆, 唐萌, 张婷, 陆敏玉, 杨扬, 张姗姗, 孔璐, 刘晓闰, 薛玉英, 张宇. 不同量子点诱导L 929细胞氧化损伤及凋亡作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(8): 975-977.
WANG Yi-qing, TANG Meng, ZHANG Ting, et al. Effect of oxidative damage and apoptosis of different quantum dots on L929 cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(8): 975-977.
不同量子点诱导L 929细胞氧化损伤及凋亡作用
王宜庆1,2, 唐萌1,2 , 张婷1,2, 陆敏玉1,2, 杨扬1,2, 张姗姗1,2, 孔璐1,2, 刘晓闰1,2, 薛玉英1,2, 张宇2,3    
1. 环境医学工程教育部重点实验室东南大学公共卫生学院, 江苏南京210009;
2. 江苏省生物材料与器件重点实验室;
3. 东南大学生物科学与医学工程学院
收稿日期: 2011-02-23.
基金项目: 国家自然科学基金(3067178230972504);国家重点基础研究“973计划”(2006CB705602);国家重大科学研究计划(2011CB933404)
作者简介: 王宜庆(1984- ),男,江苏连云港人,硕士在读,研究方向:纳米毒理学。
通讯作者: 唐萌,E-mail:tm@seu.edu.cn
摘要: 目的 探讨量子点CdSe及2种不同粒径的CdTe对L 929细胞增殖能力、氧化损伤和凋亡的影响。方法 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测3种量子点对L 929细胞增殖活力的影响;检测染毒后L 929细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)和羟自由基(·OH)的含量及细胞凋亡情况。结果 染毒24 h后半数抑制浓度(IC50)为:2.2 nm CdSe 27.14μg/mL,2 nm CdTe 28.28μg/mL,3.5 nm CdTe 79.30μg/mL;不同粒径的2种CdTe比较,14μg/mL剂量时,GSH-Px和.OH指标差异有统计学意义(P＜0.05);3种量子点的高剂量组细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),不同粒径的2种CdTe比较,各剂量组差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 量子点可以抑制小鼠成纤维细胞增殖能力,并发生氧化损伤作用,诱导细胞凋亡,量子点的粒径大小为其引起细胞毒性的重要因素。
关键词: 量子点     CdSe     L929细胞     氧化损伤     细胞凋亡     细胞毒性    
Effect of oxidative damage and apoptosis of different quantum dots on L929 cells
WANG Yi-qing, TANG Meng , ZHANG Ting, et al    
Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China
Abstract: Objective To study the effects of different quantum dots(QDs)(CdSe particles of 2.2 nm and CdTe particles of 2.0 and 3.5 nm in diameter)on proliferation activity,oxidative damage,and apoptosis of L929 cells. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was applied to test the proliferation activities of L929 cells.Twenty-four hours after the treatment,malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD),glutathione-peroxidase(GSH-Px),and hydroxy radical(·OH)in the cells were determined.The apoptosis was detected with flow cytometry. Results The 50%inhibitory concentrations(IC50)was 27.14μg/mL for 2.2 nm CdSe,28.28μg/mL for 2.0 nm CdTe,and 79.30μg/mL for 3.5nm CdTe,respectively.There were statistically significant differences in·OH and GSH-Px contents between two groups with different size QDs exposure at the dose of 14μg/mL(P<0.05).The apoptosis of each group at the dose of 14μg/mL had significant difference compared with that of the control group and there also was a significant difference between the groups with QDs exposure of different size of the same dose. Conclusion QDs can inhibit the proliferation and induce oxidative damage and apoptosis of L929 cells and the size of QDs is an important influential factor of cytotoxicity.
Key words: quatum dots(QDs)     CdSe     L929 cell     oxidative damage     apoptosis     cytotoxicity    

量子点是一种新型荧光纳米材料，由于其优异的荧光特性〔1〕而广泛应用于荧光检测、活细胞和活体动物示踪观察及影像诊断等领域〔2〕。其生物安全性也日益受到关注，研究表明，量子点的毒性与粒径、表面修饰、暴露浓度和时间等因素有关〔3〕。本实验采用目前生物学研究领域中应用较多的硒化镉和碲化镉量子点方法，从粒径和结构角度分析其在不同剂量下对小鼠成纤维细胞的毒性作用，观察氧化损伤及凋亡影响，分析毒性机制，为量子点生物安全性评价及荧光标记物的安全应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 细胞株

L929小鼠成纤维细胞(中国科学院上海细胞生物研究所)。

1.1.2 试剂与仪器

CdSe(粒径2.2nm，发绿光，发射波长为536nm)，CdTe(粒径2、3.5nm，分别发绿光和红光，发射波长为547、622nm)由东南大学生物科学与医学工程学院制备;高糖达尔伯克氏改良伊戈尔氏培养基(Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM，美国Gibco公司);四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美国Sigma公司);丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、羟自由基(hydroxyl free radical，·OH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和考马斯亮兰(coomassie brilliantblue)蛋白含量测定试剂盒(南京建成生物技术公司);磷酯酰丝氨酸荧光素探针凋亡检测试剂盒(annexin-v-fluorescein isothiocyanate，annexin-VFITC，凯基生物科技发展有限公司);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美国Sigma公司);BB5060UV型CO2培养箱(香港Heal Force Development公司);CK40-F200型倒置显微镜(日本Oympus公司);MRX型全自动酶标仪(美国Dynex Technologies公司);722N型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);FCSCantoTM流式细胞测定仪(美国BD公司)。

1.2 方 法 1.2.1 细胞抑制率测定

L929细胞采用常规传代培养，取生长状态良好的对数生长期细胞接种于96孔培养板，接种密度为0.5×105个/mL，培养24h弃培养液，每孔加入浓度分别为0(生理盐水对照组)、8.78、13.17、19.75、29.63、44.44、66.67、100和150μg/mL的量子点(2.2nmCdSe，2、3.5nmCdTe)溶液，每剂量组设4个复孔。24h后检测MTT结果，方法参照文献〔4〕。根据酶标仪测定的吸光度A值计算细胞抑制率，抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。Bliss法计算半数抑制浓度(50%inhibitoryconcentration，IC50)。

1.2.2 氧化损伤指标的测定

将密度为0.5×105/mL的细胞接种于6孔培养板，每孔3mL，24h后弃培养液，加入终浓度分别为0(溶剂对照组)、3.5、7、14μg/mL的量子点溶液，每剂量组设3个平行孔，染毒24h后终止培养。去除各组游离量子点，超声破碎细胞后收集细胞裂解液，离心后取上清，按试剂盒说明书测定MDA、GSH-Px、SOD和·OH含量。

1.2.3 细胞凋亡率测定

种板和染毒方法同上，24h后收集漂浮和消化下的细胞离心去上清，按试剂盒说明书操作，进行流式细胞仪检测。

1.3 统计分析

采用SPSS 13.0软件统计处理数据，各剂量组与阴性对照组结果以单因素方差分析和Dunnett's t检验比较，不同核结构和不同粒径量子点间用t检验比较。

2 结 果 2.1 不同量子点对L929细胞的增殖抑制作用(图 1)
图 1 3 种量子点不同浓度下对L 929 细胞的生长抑制率曲线

图 1可见，各染毒组均对细胞有明显的生长抑制作用，且随剂量的增加，细胞抑制作用的整体趋势为逐渐增强。其中，2.2nmCdSe和2nmCdTe组细胞抑制率上升较快。Bliss法求得3种量子点的IC50为:2.2nmCdSe27.14μg/mL，2nmCdTe28.28μg/mL，3.5nmCdTe79.30μg/mL。可见2种相同粒径的CdSe和CdTe毒性大致相同，粒径较大的3.5nmCdTe毒性较小。

2.2 不同量子点对L929细胞中MDA、SOD、GSH-Px和·OH含量的影响(表 1)
表 1 3 种量子点对L 929 细胞氧化损伤指标的影响(±s，n = 3)

结果表明，随染毒剂量的增加，MDA和·OH含量升高，SOD和GSH-Px含量降低，表现出一定的剂量效应关系。与对照组相比，除3.5nmCdTe的MDA和·OH外，14μg/mL处理组的各氧化损伤指标与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。不同粒径的2种CdTe比较，在14μg/mL剂量时，GSH-Px和·OH2项指标差异有统计学意义(P＜0.05)。而粒径相同的2种不同结构的量子点之间相比，各项指标差异无统计学意义。

2.3 不同量子点对L929细胞凋亡率的影响(表 2)
表 2 3 种量子点对L 929 细胞凋亡率的影响(±s，n = 3)

结果表明，各剂量组细胞凋亡率随着染毒剂量的增加而增加，且明显高于对照组。3种量子点的高剂量组处理细胞后，细胞凋亡率与正常对照比较差异有统计学意义(P＜0.05)。不同粒径的2种CdTe比较，各剂量组差异均有统计学意义(P＜0.05)。而粒径相同的2种不同结构的量子点之间比较，差异无统计学意义。

3 讨 论

因量子点粒径较小，容易进入机体、器官、细胞甚至细胞器中，且量子点核心由Cd2+等重金属元素组成，在细胞内降解后释放重金属离子，具有一定的细胞毒性。本实验表明小尺寸的量子点具有更大的细胞毒性，这一结果与Lovric等〔5〕研究结论相似。在19.75μg/mL浓度前后2种粒径相同的量子点又表现出不同的毒性大小，提示在一定剂量范围内，相同粒径的量子点会由于不同的核结构表现出不同的毒性，这可能与量子点在生物微环境下的稳定性有关;氧化应激被认为是纳米材料毒性作用的重要机制之一，综合MDA、·OH、GSH和SOD4项指标可反映机体内氧化应激水平〔6〕。GSH-Px和SOD是细胞内抗氧化物质，其含量减少，说明自由基清除能力下降，可造成自由基的过量累积，当·OH含量达到一定程度时，可引起细胞的脂质过氧化，表现MDA含量持续增加〔4〕。这一过程也促使细胞膜结构受到损伤，从而引起细胞的破坏、老化和功能障碍〔7〕。此外，量子点能显著增加L929细胞凋亡率并且发生凋亡的细胞数高达42.20%，这与殷海荣〔8〕等所研究的CdTe诱导的RAW264.7细胞凋亡率相近。

综合以上研究结果推测，量子点细胞毒性主要与粒径有关，它可诱导细胞产生大量自由基，发生氧化损伤，诱导细胞发生凋亡，影响细胞的增殖活性。

参考文献
〔1〕 Vasudevanpillai B,Tamitake I,Abdulaziz A,et al.Semiconductor quantum dots and metal nanoparticles syntheses optical properties and biological applications[J].Anal Bioanal Chem,2008,391:2469-2495.
〔2〕 Walkey C,Sykes EA,Chan WCW.Application of semiconductor and metal nanostructures in biology and medicine[J].Nanotechnology For Hematology,2009,1:701-707.
〔3〕 Zhang LW,Monteiro-Riviere NA.Mechanisms of quantum dot nanoparticle cellular uptake[J].Toxicological Sciences,2009,110(1),138-155.
〔4〕 殷海荣,唐萌,夏婷,等.量子点CdTe对RAW 264.7细胞凋亡和脂质过氧化水平的影响[J].中国现代医学杂志,2008,8(18):2593-2596.
〔5〕 Lovric J,Bazzi HS,Cuie Y,et al.Differences in subcellular distribution and toxicity of green and red emitting CdTe quantum dots[J].J Mol Med,2005,83(5):377-385.
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〔7〕 Clift MJ,Boyles MS,Brown DM,et al.An investigation into the potential for different surface-coated quantum dots to cause oxidative stress and affect macrophage cell signaling in vitro[J].Nanotoxicology,2010,4:139-149.
〔8〕 殷海荣,唐萌,夏婷,等.量子点(CdTe)诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡与线粒体膜电位的影响[J].南开大学学报:自然科学版,2008,41(3):5-9.