医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织,是可靠的分子生物学研究材料来源。自1985 年Goelz 等^[1]首先成功从4%甲醛固定的石蜡包埋组织中提取出DNA 之后,许多学者对石蜡包埋组织提取DNA 的方法进行了研究。在实际工作中由于某些因素干扰,石蜡包埋组织中结核杆菌DNA 的检测仍存在诸多问题^[2]。石蜡包埋样品PCR 扩增成功率很低,原因之一是模板DNA 的质和量不够^[3]。因此,本研究从实际应用角度出发,寻找自普通4% 甲醛固定石蜡包埋肺或淋巴结组织中提取结核杆菌DNA 的最佳方法。

20 份2009 年诊断为结核且抗酸染色阳性的4%甲醛固定石蜡包埋的肺或淋巴结组织标本来自广西医科大学第一附属医院病理科。每例切片10 μm × 40片,每10片放入一个1.5 mL无菌离心管中,随机分成4组,每组20例进行实验。

二甲苯,无水乙醇,醋酸铵,苯酚-氯仿-异戊醇(体积比为25: 24: 1),3 mo l/L的N aC l溶液,消化缓冲液[0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCL、1 mmol/L 乙二胺四乙酸、1% 十二烷基硫酸钠、4 mmol/L 尿素、1% Triton X -100]; 蛋白酶K、Premix taq (美国Takala 公司),DNA 抽提试剂盒(美国Omega公司),结核杆菌特异性引物和检测探针(南宁中加免疫生物科技有限公司),尼龙膜(美国Pall公司),辣根过氧化物酶母液和四甲基联苯胺(深圳亚能生物公司)。

4组样本每管加1 mL二甲苯充分摇匀,65℃ 水浴20 min。10 000 r/min离心8 min,弃上清,无菌棉签吸干。重复1 次。加入1 mL无水乙醇,摇匀后室温放置5 min,10 000 r /min 离心8 min,弃上清,重复1次。室温放置至乙醇全部挥发。加入200 μL 消化缓冲液和20 μL20 mg/mL蛋白酶K^[4],摇匀后56℃ 水浴^[5] 3 h,追加30 μL蛋白酶K; 消化过夜至组织液澄清透明。沸水浴10 min以灭活蛋白酶K。

第1 组样本加入等体积3 m ol/LNaC l溶液,混匀,冰浴30 min。10 000 r /min离心8 min,取上清。加2倍体积冰冻无水乙醇置于- 20℃ 2 h,12 000 r /min离心10 min,弃上清。沉淀加入500 μL 75% 乙醇,混匀,12 000 r /min离心10 min,弃上清后晾干。沉淀加入50 μL 灭菌注射用水,混匀,可作PCR模板或- 20℃ 保存。

第2组样本按文献^[6]进行。

第3组样本以12 000 r /min离心10 min,取上清作PCR模板或- 20℃ 保存。

第4组样本按美国OMEGA 公司试剂盒(D6296- 01)的说明进行。

每管取5 μL,加ddH₂O 稀释至300 μL,用紫外分光光度计测定每管的A₂₆₀及A₂₈₀,计算DNA产量及A₂₆₀ /A₂₈₀比值。

每管取3 μL,与1 μL的上样缓冲液混匀后点样于核酸染料染色的1% 琼脂糖凝胶上,空白对照为灭菌双蒸水,90 V电泳30 min。用紫外凝胶成像仪观察DNA条带。

利用一对针对结核杆菌的特异性引物扩增结核杆菌插入序列IS6110。阳性对照模板为结核杆菌菌株DNA提取液,空白对照模板为灭菌双蒸水。PCR 反应体系为25μL: 上下游引物(10 μmol/L) 各1.0 μL,Premix taq13.0 μL,模板DNA 5.0 μL,ddH₂O 5.0 μL。反应条件为: 95℃ 预变性5 min,94℃ 45 s,59℃ 45 s,72℃ 50 s,共40个循环,72℃ 延伸8 min。各组PCR产物取5 μL 分别点样于核酸染料染色的2%琼脂糖凝胶上,90V 电泳35 min。通过观察样本目的DNA条带大小及ImageJ 软件计算灰度值来推测所提目的DNA优劣。

参见文献^[6]。

对各组DNA 总产量、A₂₆₀ /A₂₈₀比值及目的DNA条带的灰度值应用SPSS 13.0进行方差分析,以P <0.05 为差异有统计学意义。

氯化钠盐析法、一步法、酚- 氯仿法与试剂盒法所得DNA 总产量分别为(19.338 ±6.270)、(20.050 ± 5.591)、(10.763 ± 6.658) 和(7.575 ±5.011) ± g,A₂₆₀ /A₂₈₀比值分别为(1.044 ± 0.137) 、(1.813 ±0.152)、(1.853 ± 0.132) 和(1.780 ± 0.131),差异均有统计学意义(FA₂₆₀ /A₂₈₀ = 175.101,FDNA 总产量= 218.563,P <0.01)。

电泳结果(图 1) 各组均出现了基因组DNA条带,并显示存在DNA 链降解现象^[6]。其中,一步法条带包含有大片段DNA (> 1200bp),氯化钠盐析法所得DNA条带在200~ 1200bp之间,而酚- 氯仿法和试剂盒法提取的DNA条带分别为100~ 700bp和500 ~ 700bp,主要为降解片段。

图 1

注: M: Marker II,1: 氯化钠盐析法,2: 酚- 氯仿抽提法,3: 一步法,4: 试剂盒法,- : 空白对照。 图 1 基因组DNA 电泳图谱

各组PCR 产物均在250bp左右位置出现目的条带,但一步法PCR产物得率低且引物二聚体明显。氯化钠盐析法(147.685 ± 13.444) 与酚- 氯仿法(148.933 ± 12.312) 的目的条带灰度值均明显大于一步法(18.109 ± 11.292) 和试剂盒法(88.027 ± 11.370) (F =1040.239,P < 0.01)。提示氯化钠盐析法和酚- 氯仿法提取结核杆菌DNA 的扩增效率优于试剂盒法和一步法。

图 2

注: M: Marker I; + : 阳性对照; 1: 氯化钠盐析法; 2: 酚- 氯仿抽提法; 3: 一步法; 4: 试剂盒法; - : 空白对照。 图 2 PCR扩增图谱

氯化钠盐析法、酚- 氯仿法和试剂盒法提取的结核杆菌DNA 膜芯片检测均出现阳性结果,一步法无显色。说明前3种方法的膜芯片均检测出结核杆菌IS6110基因,而一步法未能测出。

研究表明氯化钠盐析法与酚- 氯仿抽提法效果相当^[7]。本研究将常见的几种DNA 提取方法应用于石蜡包埋组织中结核杆菌DNA的提取。结果显示,盐析法所得DNA 总产量明显高于酚- 氯仿法和试剂盒法,原因为盐析法在操作过程中减少了移管、震摇和离心次数,降低DNA丢失及机械损伤,从而提高了DNA产量。一步法因含残余蛋白质及其他杂质较多使DNA不纯致其A₂₆₀ /A₂₈₀比值明显低于其余3种方法。

DNA电泳结果显示4种方法所提取的DNA均有不同程度降解现象。盐析法和一步法所得DNA片段相对较大,说明可能存在比较完整基因组DNA。分析结核杆菌特异基因扩增片段,盐析法和酚- 氯仿法均得到了亮度和纯度较理想目的条带,而试剂盒法的扩增产物得率较低,这与DNA 产量及电泳结果相吻合。一步法扩增条带肉眼几乎看不清,引物二聚体明显,原因可能是由于该法提取的DNA 中存在着一些不能通过蛋白酶K 消化去除的PCR 反应抑制因子^[8],降低了Taq酶活性,同时干扰引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。分析本次膜芯片检测结果,盐析法、酚- 氯仿法和试剂盒法均得到了阳性结果,而一步法的检测结果为阴性,可能原因为PCR 产物中目的DNA 含量过少而其他杂质较多; 这些杂质中可能含有抑制杂交、酶联、显色等反应的物质。

氯化钠盐析法在提取甲醛固定石蜡包埋组织中DNA 的产率和纯度上与酚氯仿法和试剂盒法相当,并且简化了操作步骤,减少了实验成本,还能避免苯酚、氯仿等有毒试剂,同时减少仪器设备的损耗,因此是一种值得完善和推广的DNA 提取方法。