近年来,手足口病(HFMD)疫情不断上升,多数病例通常症状较轻,根据典型的皮疹或疱疹即可做出诊断,但对于重症病例、临床诊断不明以及聚集病例,进行实验室病原学鉴别诊断具有重要的意义^[1]。为掌握河北省唐山市手足口病病原学分布及其特点,本研究对2009年唐山市疑似肠道病毒感染病例标本肠道病毒71 型(EV71) 和柯萨奇病毒A16 型(CA16)进行实验室鉴别诊断,并对检测结果进行分析。结果报告如下。

2009年4-11月采集唐山市幼儿园及小学聚集性手足口病病例、各级医院临床诊断疑似肠道病毒感染患儿351例,其中男性214例(61.0%)、女性137例(39.0%); 年龄最小为4月龄,最大为13岁,平均为3.2岁。

(1) 标本采集: 采集患儿咽拭子、疱疹液或肛拭子标本351份,标本采用低温运送立刻用于检测或- 70℃ 冻存待检。(2)主要试剂及仪器: RNA 提取试剂盒Q IAamp Viral RNA Minikit(德国QIAGEN 公司); 荧光定量PCR试剂盒enterovirus type 71 real time RTPCR Kit,coxsackie Virus A16 real time RT-PCR kit(上海之江生物科技有限公司); 7500 real time PCR system (美国AB公司)。(3) 病毒核酸检测: 病毒核酸RNA提取按照试剂盒说明书进行; Real Time RTPCR 扩增预混合试剂操作均按照试剂盒说明书进行,荧光PCR反应条件为: 45℃ 10 m in; 95 ℃ 15 m in; 95 ℃ 60 s,60 ℃ 60 s,40个循环; 反应体系为25 μL (核酸荧光PCR 检测混合液19 μL,RT-PCR 酶1μL,模板5 μL),单点荧光检测温度为60℃ ,选用FAM 通道,实验结果进行扩增曲线和C t值分析,待检样品FAM 通道C t≤ 38则报告为阳性。

使用Micrsoft Excel 2003建立数据库,使用SPSS 11.5软件进行χ²检验及Binary Logistic分析。

351 份标本中,共检出EV71和CA16 核酸阳性103 例,总阳性检出率为29.3%。其中EV71阳性40 例,检出率为11.4% (40 /351),CA16 阳性63例,检出率为17.9% (63 /351)。男性患儿EV71核酸阳性检出率为9.8% (21 /214) ,CA16核酸阳性检出率为14.0% (30 /214); 女性患儿分别为13.9% (19 /137)、24.1% (33 /137)。不同年龄组中,4岁儿童感染EV71和CA16的比例分别占80.0% (32 /40)和79.4% (50 /63)。

表 1

表 1 不同年龄、性别患者EV71和CA16核酸检出率 组别 检测例数 EV71 CA16 阳性数 阳性率(% ) 阳性数 阳性率(% ) 性别 男性 214 21 9.8 30 10.4 女性 137 19 13.9 33 24.1 年龄(岁) 0 ~ 81 12 14.8 14 17.3 2 ~ 85 8 9.4 14 16.5 3 ~ 54 6 11.1 9 16.7 4 ~ 63 6 9.5 13 20.6 ≥ 5 68 8 11.8 13 19.1

表 1 不同年龄、性别患者EV71和CA16核酸检出率

2009年5月份,唐山市HFMD病例急剧增加,6 - 8月份病例呈逐渐下降趋势,8月份(41例)与4月份(47例) 病例数基本相同,9- 11月病例数分别为3例、2例和1例,5- 7月份为HFMD 发病高峰。实验室检测结果显示,5- 7月份共检出肠道病毒核酸阳性76例,占全年总阳性数的73.8%; 其中EV71和CA16病毒核酸阳性分别为32例和44例。8月份CA16病毒核酸阳性检出率为36.6%(15 /26),EV71病毒核酸阳性检出率仅为4.9% (2 /41)。

图 1

图 1 唐山市2009年不同月份EV71 和CA16检出阳性数

351 例中,临床诊断为重症病例74例,占21.1%; 其中,EV71 阳性40例中,重症病例19例,占47.5%,EV71阴性311例中,重症病例55例,占17.7%,差异有统计学意义(OR = 4.2,95%CI= 2.1~ 8.3; χ² = 18.9,P < 0.01) ; CA16阳性63例中,重症病例13例,占20.6%,CA16 阴性288 例中,重症病例61例,占21.2%,差异无统计学意义(OR = 0.9,95% CI= 0.5~ 1.9;χ² = 0.01,P = 0.92) 。

EV71和CoxA16是H FMD的主要病因,在许多国家和地区引起手足口病的爆发和流行。虽然引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型(EV71)和A 组柯萨奇病毒(CoxA)、埃可病毒(Echo)的某些血清型,但EV71感染引起重症病例的比例较大^[2]。本研究结果表明,唐山2009年同时出现EV71和CA16交替感染现象,且EV71 阳性的重症病例比例高于EV71阳性者,与有关结果一致^{[2, 3]}。提示从临床标本中鉴别诊断EV71对临床选择治疗方案具有重要意义。

本研究显示,4岁及以下儿童是HFMD最主要的发病人群,感染EV71 和CA16 病毒的比例分别占到80.0% 和79.4%,与以往研究结果相似^[3]。从肠道病毒感染的季节分布上,春夏季是唐山市H FMD 的高发季节,自4 月份起病例逐渐增多,5月份达到高峰,但在8月份出现15例CA16病毒感染者,这种反复暴发现象的原因尚不明确。由于目前我国尚未研制出相应的疫苗,因此在手足口病流行季节做好消毒、隔离等预防措施仍然是未来数年内手足口病防控工作的重中之重,同时从临床标本中及时准确地鉴别诊断EV71,有助于疾病的流行趋势预测以及医疗机构选择相应的治疗措施,从而减少重症病例和死亡的发生^[3]。