叶黄素( lute in,Lut) 是富集于视网膜中一类主要类胡萝卜素,与白内障、黄斑变性等眼睛老化疾病呈负相关^[1],具有抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用^[2]。研究显示,异黄酮具有抑制氧化损伤、提高小鼠体内抗氧化酶活性等作用^[3]。卵磷脂为细胞膜及脑神经细胞的重要成分,具有改善儿童记忆能力的作用^[4]。为了解有关叶黄素、大豆甙元及卵磷脂联合应用改善认知行为能力的作用,本研究通过对3种物质单独及联合应用对小鼠认知行为能力的影响及可能作用机制进行探讨。

叶黄素( lute in,瑞士DSM Nutritiona l Produc ts公司,纯度5% ); 卵磷脂( lec ith in,北京绿之源生物技术有限公司,纯度15% ); 大豆甙元( daidzein,陕西省禾烨生物工程有限公司,纯度98% )。

SPF级12周龄昆明( KM )雄性小鼠144只,体重32~ 35 g,群笼饲养( 6只/笼),自由摄食与饮水,24 h 人工节律。

LD5-10B低速离心机(北京仪器厂);CS-15R控温离心机( 美国Beckm an公司); UV- 1600 紫外-可见分光光度计(北京瑞利化学分析仪器厂) ; F-4000荧光分光光度计(日本H itach i公司); DMS-2M o rris水迷宫、小鼠跳台仪(中国医学科学院药物研究所) 等。谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px)、总超氧化物歧化酶( T-SOD)、丙二醛(MDA ),乙酰胆碱转移酶( ChAT)、胆碱酯酶( TChE )、单胺氧化酶(MAO)和微量蛋白( Pr)、一氧化氮( NO)试剂盒(南京建成生物研究所); 5-羟色胺( 5-HT ) 和去甲肾上腺素( NE ) ELISA 试剂盒(美国Adlitteram D iagno stic Labo ra to ries公司)。其中微量蛋白量代表所测组织量。

小鼠适应喂养1周后,随机分为两大组,每大组72只(调整体重,2组差异无统计学意义),分别进行电击跳台实验和M orris水迷宫实验。每大组再随机分为6组,每组12只,分别为: 阳性对照组[咯利普兰,0.01 mg / ( kg• bw)]、空白对照组[纯玉米油0.1 mL/ ( kg•bw )2]、叶黄素组[2 mg /( kg• bw )]、卵磷脂组[200 mg / ( kg• bw )]、大豆甙元组[60 mg /( kg• bw )]及叶黄素+ 卵磷脂+ 大豆甙元混合组[2 mg /( kg• bw ) + 200 m g /( kg• bw) + 60 mg / ( kg• bw) 2]。将受试物溶于玉米油后经口灌胃给予,每周称量体重,调整灌胃量为[0.1 mL / ( kg• bw )],每天相同时间灌胃1 次,连续4周后进行为期2周的行为学测试,测试期间持续给药; 共6周。

跳台和M orr is水迷宫实验参照文献^{[5, 6]}方法。

小鼠学习行为学测试结束后第2 d,腹腔静脉取血,自然凝血取血清; 颈椎脱臼法处死小鼠留取脑组织,生理盐水漂洗; 所有样品都液氮冷冻,- 80℃ 保存备测。

GSH-Px、T-SOD、MDA,ChAT、TChE、MAO、Pr、NO、5-HT和NE按试剂盒说明进行生化指标测定。

参照文献^[7]。

应用SPSS 13.0软件进行分析,各组均数间比较采用单因素方差分析。

卵磷脂组、大豆甙元组、混合组及阳性对照组小鼠24 h 测试期错误次数分别为( 1.36±0.27)、( 1.00±0.23)、( 0.92±0.26)、( 1.13±0.19)次,1周后消退期错误次数分别为( 1.07±0.27)、( 0.56±0.15)、( 1.20±0.26)、( 1.60±0.45 ) 次,均明显低于与空白对照组的( 2.07±0.44)、( 2.13±0.34) 次(P ＜0.05,P ＜0.01); 卵磷脂组、混合组小鼠24 h 测试潜伏期为( 97.56±16.72)、( 110.77±19.90) s,明显长于空白对照组的( 40.00±15.62 ) s ( P ＜0.05); 叶黄素组、卵磷脂组、大豆甙元组及混合组小鼠1周后消退潜伏期分别为( 88.67±16.24 )、( 103.60 ±17.72)、( 124.44±16.84)、( 93.58±18.86) s,均明显长于空白对照组的( 37.2±11.98) s ( P＜0.05,P ＜0.01)。

M orr is水迷宫测试中叶黄素组、大豆甙元组、混合组及阳性对照组逃避潜伏期分别为( 23.09 ± 6.59 )、( 22.29 ± 7.33 )、( 21.45 ± 5.45 )、( 17.54 ± 6.65) s,均明显低于空白对照组的( 45.80 ± 9.70) s( P＜ 0.05,P ＜ 0.01)。

叶黄素组、大豆甙元组、卵磷脂组、混合组及阳性对照组小鼠脑GSH-Px 活性,大豆甙元组、混合组脑T-SOD 活性均高于空白对照组,但差异均无统计学意义; 其他5组小鼠脑MDA 含量均低于空白对照组,除叶黄素组和阳性对照组外,差异均有统计学意义( P＜ 0.05,P ＜ 0.01) 。

表 1 (Table 1)

表 1 各组小鼠脑组织GSH-Px、T-SOD活性和MDA 含量( x±s, n= 12) 组 别 [mg /( kg• bw )] G SH-Px T-SOD MDA [ U / (mg• prot) ] [ U /( mg• p rot) ] [ nmo l/ (mg• prot) ] 空白对照组 29.5±5.4 96.1±8.8 3.8±0.5 叶黄素组 2 32.9±3.5 95.2±4.7 3.7±0.4 大豆甙元组 60 32.6±5.6 97.7±13.2 3.4±0.4a 卵磷脂组 200 33.9±9.2 95.3±8.1 3.4±0.4a 混合组 2 + 200+ 60 33.8±2.7 105.0±13.5 3.2±0.3 b 阳性对照组 0.01 30.7±6.8 95.2±8.3 3.8±0.6  注: 与空白对照组[ 0.1mL / ( kg• bw )]比较, a P＜ 0.05, b P＜ 0.01。

表 1 各组小鼠脑组织GSH-Px、T-SOD活性和MDA 含量( x±s, n= 12)

与空白对照组比较,混合组及阳性对照组小鼠脑ChAT 活性明显升高(P ＜0.01) ; 混合组小鼠脑TChE 活性明显降低( P ＜0.05);叶黄素组、大豆甙元组、混合组及阳性对照组小鼠血清TChE活性明显降低( P ＜0.05)。

表 2 (Table 2)

表 2 脑组织ChAT、TChE及血清TChE活性( x±s, n= 12) 组 别 [ mg /( kg• bw ) ] 脑 血清TChE( U /mL) ChAT( U /g) TChE [U /( mg• prot) ] 空白对照组 89.16±33.21 0.28±0.062 48.41±4.48 叶黄素组 2 111.25±28.22 0.26±0.036 42.42±5.43a 大豆甙元组 60 97.55±29.55 0.24±0.080 43.80±6.50a 卵磷脂组 200 105.94±20.77 0.25±0.063 42.90±5.07 混合组 2+ 200+ 60 129.83±29.48b 0.22±0.022a 41.11±2.57a 阳性对照组 0.01 150.55±40.11b 0.24±0.037 41.25±6.48a  注: 与空白对照组[ 0.1mL / ( kg• bw ) ]比较, a P ＜ 0.05, bP ＜ 0.01。

表 2 脑组织ChAT、TChE及血清TChE活性( x±s, n= 12)

与空白对照组比较,其他5组小鼠脑MAO 活性均降低,但只有卵磷脂组差异有统计学意义( P＜ 0.05),其他5组5-HT含量均明显增高( P ＜ 0.01) ,叶黄素组、卵磷脂、混合组及阳性对照组小鼠脑NE 含量也均明显增高( P＜ 0.05,P ＜0.01)。

表 3 (Table 3)

表 3 小鼠脑组织中MAO、5-HT和NE水平( x±s, n= 12) 组 别 [m g / ( kg• bw ) ] MAO 5-HT NE NO [U / (m g• prot ) ] ( ng /mL) ( ng /mL) [ Lm o l/ ( g• pro t) ] 空白对照组 13.34±1.49 171.61±32.94 93.25±7.33 1.54±0.20 叶黄素组 2 11.85±2.87 210.08±20.46b 104.09±7.63a 1.53±0.53 大豆甙元组 60 12.69±2.80 222.95±15.87b 101.22±6.29 1.32±0.24 卵磷脂组 200 10.80±2.05a 225.18±24.56b 106.12±7.25b 1.28±0.22 混合组 2+ 200+ 60 11.00±1.96 237.97±29.30b 108.84±16.94b 1.03±0.11 阳性对照组 0.01 11.71±1.19 219.48±22.50b 105.60±8.10b 1.62±0.59  注: 与空白对照组[ 011mL / ( kg• bw ) ]比较, aP ＜ 0.05; bP＜ 0.01。

表 3 小鼠脑组织中MAO、5-HT和NE水平( x±s, n= 12)

微粘度η越大,膜脂流动性越小;η越小,膜脂流动性越大。与空白对照组微粘度η( 5.622±0.339)比较,叶黄素组、大豆甙元组、卵磷脂、混合组及阳性对照组分别为( 5.155±0.415 )、( 5.182± 0.386 )、( 5.189± 0.358)、( 5.114 ±0.183)、( 4.996±0.403 ),均明显降低( P ＜ 0.05,P ＜0.01),表明小鼠脑神经细胞膜脂流动性均明显增高。

本研究中跳台和Mo rris水迷宫实验结果表明,单独补充叶黄素可明显改善小鼠主动学习、记忆保持能力; 卵磷脂可明显改善小鼠主动学习、被动学习、记忆保持能力; 大豆甙元可明显改善小鼠主动学习、记忆保持能力; 三者联合补充对小鼠主动学习、被动学习、记忆保持能力均有明显改善效果。5-HT与胆碱能神经递质系统之间有交互影响作用,对记忆起调节功能^[8]; NE与学习、记忆的巩固也有关^[9]。细胞膜脂流动性是细胞膜结构的重要特征,适宜的膜脂流动性对细胞膜正常功能具有重要作用,是细胞进行正常生命活动的必要条件。本研究结果表明,单独以及联合补充叶黄素、大豆甙元、卵磷脂能不同程度地增加小鼠脑GSH-Px、T-SOD活性,降低脑MDA 含量,进而改善小鼠脑抗氧化体系; 提高小鼠脑ChAT活性,降低小鼠脑TChE、MAO 活性,进而增加脑内神经递质Ach、5-HT及NE 的含量; 提高大脑神经细胞的膜脂流动性。小鼠认知行为功能的改善可能通过以上一种或几种途径而实现,具体机制有待进一步研究。