近年来,随着慢性皮肤溃疡及皮肤病患者增多,以及烧伤 及意外创伤所造成的皮肤缺损,临床上对皮肤移植的需求越 来越大,因此,表皮干细胞( ep iderm a l stem cel,l ESC ) 分离培 养的研究逐渐成为国内外学者关注的焦点^[1]。为了更深入 研究表皮干细胞培养特性,为建立体外表皮干细胞培养体系, 采用组织工程技术构建皮肤组织提供初步基础,本研究利用 W istar大鼠幼鼠表皮组织块,采用酶消化法和组织块联合培 养的方法,观察了表皮干细胞的体外分离培养及其增殖分化 过程。现将结果报告如下。

( 1)实验动物: 生后1 d的W istar大鼠幼鼠,雌雄 不限( 中国医科大学动物部提供)。( 2)试剂与仪器: 杜尔伯 科改良伊格尔培养基( Dulbecco m od ified eag le m edium, DMEM )、小牛血清( feta l bov ine serum,FBS)、β₁ 整合素多抗( 华美公司); 胰蛋白酶( 1:250,美国Sigm a 公司); 兔抗鼠β₁ 整合素单克隆抗体(工作浓度1:300)、羊抗鼠角蛋白15以及 抗癌基因p63单克隆抗体( 工作浓度1:300) (美国Neuom ark e r公司); 异硫氰荧光素FITC /CY3免疫荧光二抗( 武汉博士 得生物制品公司)。

无菌条件下,取生后1 d的 W istar大鼠幼鼠,放入75%酒精中浸泡3~ 5 m in,取出用无菌 磷酸盐缓冲液冲洗,放入培养皿中,用眼科手术剪沿幼鼠背部 取下2 cm -3 cm 大小的皮片,放入培养皿中,翻转皮片,用无 菌手术刀轻轻刮除皮下组织直至发白,然后用手术剪将皮片 剪成0. 5 cm-0.5 cm 大小,放入盛有0.5%胰酶的锥形瓶中, 37℃水浴消化,20 m in /次,连续3次后,进入4℃冰箱中过 夜,次日取出后,用眼科镊子将各个皮片移入100 mL培养瓶 中,平铺于瓶底,翻转,使瓶底向上,加入DMEM 培养液,放入 培养箱中,4 h后,轻轻翻转培养瓶,37℃,5% CO₂ 培养,每2 d 换液,每日用相差显微镜观察皮片周围变化。

( 1)分离培养: 待培养 的表皮细胞铺满培养瓶底后,加入0.25%胰酶,37℃振荡消 化10~ 15 m in,10% FBS 终止消化,1 000 r /m in 离心,弃上 清,加入DMEM 培养基,移至1% 多聚赖氨酸包被培养瓶, 37℃静置10~ 15 m in,部分细胞已贴壁后,更换培养基,置 37℃、5% CO₂ 细胞培养箱内培养,隔日换液。( 2)鉴定: 选择 0.2 mg /mL多聚赖氨酸粘附15 m in的细胞,分别用以FITC / CY3标记的β₁ 整合素、K15以及p63 免疫细胞化学荧光染 色,采用激光共聚焦显微镜观察结果。

取第二代表皮干细胞,以生后 1 d的W istar大鼠幼鼠骨髓间充质干细胞( bone mesenchym a l stem ce lls,BMSC s) 作为对照,制备单细胞悬液,按200 个细 胞/孔接种于6孔板中,培养2周后,进行细胞克隆记数并计 算克隆形成率。克隆形成率(% ) = ( 细胞克隆数/接种细胞 数)×100%。

取连续培养30 d的表皮干细胞液, 离心后,置预冷的0. 25%戊二醛溶液内浸泡12 h,取出后放 入0. 1mol/L磷酸缓冲液( pH7.2) 中过夜,系列梯度酒精脱 水,醋酸异戊酯置换,二氧化碳临界点干燥,真空喷金,JSM - T300扫描电镜观察并摄片。

1.3 统计分析

应用SPSS 11. 5软件进行统计分析; 采用x² 检验,P< 0. 05为差异有统计学意义。

皮片接种24 h时,组织块边缘出 现长梭型细胞,呈栅栏状排列,成放射状生长; 2~ 3 d后,从组 织块边缘又生长出一种多角型、体积较小的细胞,处于第一种 细胞之上,并随培养时间延长,逐渐覆盖下层细胞; 同时第二 层细胞上方又生长出第三种圆形、呈集中生长的细胞,细胞大 小不一,透光性差,细胞集落生长较慢。皮片接种15 d后,在 最表层的细胞集落的边缘、中间等处出现树枝状不透光毛发 状物体(图 1) 。自然光倒置显微镜下,明显可见毛发具有竹 节样结构(图 2) ; 同时随培养时间延长,第1层梭状细胞、第2层角状细胞已经不能分辨,只有第3 层细胞可见以小圆细胞 为多,并呈集落生长,形态、大小不一(图 2)。

图 1

图 1 皮肤组织块培养表皮干细胞第15d(10×4)

图 2

图 2 皮肤组织块培养表皮干细胞第30 d( 10 × 20)

结果显示,在 所分离的细胞表面,β₁ 整合素、K15以及p63 免疫荧光细胞 化学标记均呈阳性表达,这是表皮干细胞作为成体干细胞的 生物学特性,cy3 标记β₁ 整合素、K15 的表皮干细胞在 543 nm 波长下激发红光,K15阳性部位在细胞浆( 图 3),p63 阳性部位在细胞核(图 3) ; 在488nm 波长激光下,FITC 标记 的β₁ 整合素的发绿色荧光,阳性部位在细胞膜上(图 3)。同 时具有3种标志的现象,可以证明表皮干细胞的存在。表 1 可见,表皮干细胞的克隆形成率明显高于BMSCS,差异有统 计学意义( x² = 10.36,P< 0.05)。

图 3

图 3 培养第25 天表皮干细胞内β1 整合素、K15以及p63表达

表 1 (Table 1)

表 1 表皮干细胞与BMSCS的克隆形成率比较 组别 接种细胞数(个) 克隆数(个) 克隆形成率(%) 表皮干细胞 150±23 23±53 15.3±2.3 BMSCS 165±20 11±3 6.6±1.1

表 1 表皮干细胞与BMSCS的克隆形成率比较

扫描电镜结果显示,所培养的细 胞体积小,圆形,呈集落生长,集落的中心出现竹节状的毛发, 毛发的形态不一,部分毛鳞片很发达,部分尚未被鳞片覆盖, 部分如触须一样矗立,部分从细胞周围穿过,部分已经被细胞 所包埋。在有毛发生长的地方,随着培养时间的延长,干细胞 的形态逐渐发生变化,一般由小圆形变成不规则形,部分与毛 发混交在一起。

图 4

图 4 培养表皮干细胞第30 d扫描电镜观察( × 1500)

本研究结果显示,采用冷热交替消化法对W ista r大幼鼠 表皮细胞进行培养,所建立的培养体系成功培养出具有表皮 干细胞特点的细胞。国外研究表明,表皮干细胞、间充质细胞 及真皮乳头层细胞的相互作用对毛囊等皮肤附件的形成至关 重要^{[2, 3]}。本研究所培养的表皮干细胞,生长比较缓慢,细胞 呈集落样生长,成团存在,而且在集落区域出现毛发样结构, 表明所培养的表皮干细胞能够分化出皮肤的结构^{[4, 5]},与国 外研究结果相符。

原代表皮干细胞的获取有组织块培养法及消化法2 种^[6],前者简单易行,成功率高,但由于组织块的原代细胞培 养时间较长,且并非每一组织块都有细胞萌出,细胞传代次数 和最终获取的细胞数较少,消化法对于细胞无疑有伤害,因 此,本实验采用多次、少量冷热交替酶消化法的培养体系,更 利于细胞的保护。

文献报道,多数学者采用3T3 细胞作为表皮细胞培养的 滋养层,以克服经酶消化获取的表皮细胞贴壁生长困难及抑 制成纤维细胞生长,从而得到广泛应用。但3T3细胞来源少, 价格昂贵^{[7, 8]}。本实验直接应用组织块浸没在培养基中,不 进行混杂细胞分离,而是混合培养体系培养,不仅培养出了生 物学特性明显的表皮干细胞,并且同时促进表皮干细胞的生 长和分化,毛发的出现就是最有力的证据。结果表明,直接应用组织块法,不仅使表皮干细胞的生长成为可能,又能自然地 出现皮肤附属器,且取材配制方便,价格低廉。而且在培养的 同时,混杂细胞分泌的各种细胞因子同样促进了表皮干细胞 的分化,为以后发现更优秀的培养体系打下了基础,为今后研 究皮肤的其他附属器体外的产生和进一步成熟起到了指导作 用^{[9, 10]}。

目前学术界认可并应用广泛的表皮干细胞培养成功的依 据是其在形态学上表现为非成熟细胞特征、较强的自我更新 能力( 体外培养呈克隆状生长)及对β₁ 整合素、K15以及p63 较特异表达^[11]。本实验从表皮细胞中所分离、培养的表皮干 细胞样细胞均符合以上特征。总之,本研究利用组织块法获 得的表皮干细胞数量多,而且较容易发生分化,可初步实现毛 发体外的分离培养,使体外构建组织工程皮肤变为可行。