中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (5): 574-576   PDF    
引用本文
梁志明, 杨杏芬, 杨颖, 赵敏, 黄俊明, 熊习昆, 李庆, 谭小华. 皮肤腐蚀性试验大鼠经皮电阻替代方法建立[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(5): 574-576.
LIANG Zhi-ming, YANG Xing-fen, YANG Ying, et al. Transcutaneous electrical resistance test as an alternative method of skin corrosion test in rat[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(5): 574-576.
皮肤腐蚀性试验大鼠经皮电阻替代方法建立
梁志明1,2, 杨杏芬2 , 杨颖2, 赵敏2, 黄俊明2, 熊习昆2, 李庆2, 谭小华2    
1. 中山大学公共卫生学院, 广东广州510080;
2. 广东省疾病预防控制中心
收稿日期: 2010-11-3.
基金项目: 卫生公益性行业科技专项(200802080)
作者简介: 梁志明(1984- ),男,广东顺德人,硕士在读,研究方向:应用毒理学。
通讯联系人: 杨杏芬,E-mail:yangxingfen@21cn.com
摘要: 目的 建立大鼠经皮电阻(TER)试验,并初步评价试验方法的可行性。方法 制作离体皮肤固定装置,用正常大鼠皮片固定于装置后的TER值变化及病理组织学变化来评价其可行性,参照OECD TG430的方法,采用10种化学物进行TER试验,并统计分析TER试验结果与动物试验结果的一致性。结果 正常离体皮肤固定装置24 h期间能维持屏障功能稳定,3次重复实验TER值变化曲线一致,24 h时皮片组织形态结构仍然完好;TER试验对10种化学物的腐蚀性判别结果与动物试验的结果具有一致性(Mcnemar,P=0.500;Kappa=0.615,P=0.035),灵敏度为100%,特异度为66.7%。结论 TER试验可替代家兔皮肤腐蚀性试验用于评价化学物的皮肤腐蚀性。
关键词: 皮肤腐蚀性     替代试验     大鼠经皮电阻试验    
Transcutaneous electrical resistance test as an alternative method of skin corrosion test in rat
LIANG Zhi-ming, YANG Xing-fen , YANG Ying,et al    
School of Public Health, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China
Abstract: Objective To establisha method of transcutaneous electrical resistance(TER)test and to evaluate the feasibility of the method in rat.Methods TER value and histopa thological changes of normal rat skin discs were observed to evaluate the feasibility of the isolated skin fixing aPPARγatus assembled.Tenchemicals were tested according to the Organization of Economi Cooperation and Development Guide line for Testing of Chemicals No.430.Statistical analysis was conducted to determine the relevance of the TER test compared with the data of in vivotest.Results The barrier function of normal skin discs fixed in the aPPARγatus were stable with in 24 hours and the TER value variation curve swere repea table.The morphological structure of the skin discs was intact with in 24 hours.The TER test was concordant with in vivotest for the ten reference chemicals(Mcnemar,P=0.500;Kappa=0.615,P=0.035)with the sensitivity of 100% and specificity of 66.7%.Conclusion The isolated skin fixing aPPARγatus could be used for TER test.The TER test could a lternate skin corrosion test for testing corro sive chemicals.
Key words: skin corrosion     alte rnative method     rat transcutaneous electrical resistance test    

家兔皮肤刺激性/腐蚀性试验是目前国内外评价化学物皮肤刺激性和腐蚀性的主要毒理学方法。近年来,随着动物福利和动物保护意识的提高,国际上一些实验室逐步建立了若干种皮肤刺激性/腐蚀性试验的体外替代方法 [1,2] 。其中大鼠经皮电阻( rat transcutaneo us e lectr ica l resistance,TER) 试验作为一种皮肤腐蚀性体外替代方法,已通过欧洲替代方法验证中心( European Centre for the Va lidation o f A lternativeM e thods,ECVAM ) 验证并列入经济合作与发展组织( Organization of Economic Co-operation and D eve lo pm en,t OECD ) 化学物实验操作指南 [3,4,5] 。目前该试验在国外已作为标准方法用于化学物皮肤腐蚀性的测试,本研究旨在建立适用于中国国情且简便实用的大鼠经皮电阻试验方法,并应用化学物进行测试,初步评价方法的可行性。

1 材料与方法 1. 1 受试物

在美国替代方法验证跨部门协调委员会( In teragency Coo rdina ting Comm ittee on the Va lidation of A lternative M ethods,ICCVAM )推荐的已知整体动物皮肤腐蚀性分级结果 的化学物中选取10种不同类别的化学物作为受试物[4],均为 分析纯试剂。

1.2 实验动物

SPF级雄性W istar大鼠(广东省实验动物中心), 25~ 30日龄,体重60~ 100 g,动物许可证号: SCXK(粤) 2008- 0011。

1.3 仪器设备

TH2816B精密LCR 数字电桥( 常州同惠电子有限公司),5804R 高效离心机( 德国Eppendo rf公司), HE ISO紫外可见分光光度计(上海Therm o公司) 。离体皮肤 固定装置(参考OECD TG430所示的体外皮肤腐蚀模型装置原 理[5]自制),该装置包括接收池、供给池和电极等,供给池为内 径10 mm聚四氟乙烯( po ly tetrafluo roethy lene,PTEE )管,接收池 为有机玻璃管。电桥参数为电压1.00 V,频率100 Hz。

1. 4 离体替代方法 1. 4.1 离体皮肤固定装置评价

选取同一只大鼠的8块正 常皮片固定于装置中,测定并记录0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、 3. 5、4、5、6、8、10、12、16、20、24和28 h 共18 个时间点TER 值,连续观察皮片在固定装置中TER 值变化情况,评价皮片 在染毒期间屏障功能稳定性。另将2、4、8、20 和24 h皮片与 新鲜正常大鼠皮片制作病理切片[6],对比观察皮片角质层变 化。试验重复3次。

1. 4.2 TER 试验

参照OECD TG430方法 5 进行。( 1) 皮 片制备: 颈椎脱臼处死大鼠,剥离背部皮肤,剥掉皮下多余脂 肪,剪成直径约20 mm 皮片,洗净。皮片用“O”形橡皮环固定 在PTEE管末端,多余皮肤组织剪除,石蜡封闭皮片捆扎处。 向供给池、接收池内分别加入154 mm o l/L硫酸镁溶液3、10 mL,连接电桥两电极检测皮片TER值。实验前检测每块皮片 的TER值,选择TER 值大于10 kΩ 的皮片用于正式试验。每 只大鼠取皮片8~ 10块。( 2)染毒: 染毒前将PTEE管中的溶 液倒出,再往管内加入受试物。受试物(液体取0.15 mL,固 体取适量以覆盖皮肤表面,同时加0.15 mL去离子水)与皮片 作用24 h,每种受试物设立3 个平行样。同时设立阳性对照 ( 10 m o l/L HC l溶液) 和阴性对照(去离子水) 。( 3) TER 值 测定: 染毒结束后,用水清除多余受试物,向皮片表面滴加少 量70%乙醇溶液,约3 s后弃去乙醇,向PTEE 管内加入154 mm o l/L硫酸镁溶液3 mL,将电极置于皮片两端,测量皮片 TER 值( kΩ ) 。当中性有机物或表面活性剂类化学 物染毒后皮片TER值≤5kΩ时,应进一步做硫罗丹明B染料穿透试验以排除假阳性。( 4 ) 结果判定: 根据OECD TG430,受试物染毒24 h皮片TER值>5 kΩ 时为阴性(非腐 蚀性),而TER 值< 5 kΩ 时为阳性(腐蚀性) ; 若受试物为中 性有机物或表面活性剂且染毒24 h 皮片TER值 5 kΩ 时, 须进一步进行染料穿透试验,若受试物的染料结合量大于阳 性对照物的染料结合量则为阳性,否则为阴性。

1.5 整体动物试验方法[4]

采用ICCVAM 数据库资料,选 择10种化学物家兔皮肤腐蚀性试验测试结果作为整体动物 试验结果,与体外替代试验结果进行比较。 1.6 统计分析 采用SPSS 16.0统计软件,将大鼠经皮电阻 试验结果与家兔皮肤腐蚀性试验结果进行Pea rson x2 检验、 M cNem ar检验和Kappa检验,检验水准 αΩ= 0. 05。

2 结 果 2.1 离体皮肤固定装置中大鼠皮片屏障功能 2.1.1 正常大鼠皮片TER 值变化( 图 1)

皮片置于离体皮 肤固定装置后2 h内TER值略为上升,2~ 28 h 的TER值平 稳。正常皮片在固定装置中28 h 内的TER 值变化范围在 10~ 25 k 。3次重复试验TER值变化曲线一致。

图 1 离体大鼠皮片TER值随时间变化情况
2.1.2 病理组织学变化(图 2)

随着时间推移,皮片放置于 装置后真皮层细胞逐渐出现萎缩现象。然而表皮层变化不 大,24 h时皮片表皮层完好,角质层仍然保持完整。

注: A: 新鲜大鼠皮片, B、C、D、E、F: 分别是置于离体皮肤固定装置2、4、8、20和24 h大鼠皮片。 图 2 离体大鼠皮片病理组织学变化(苏木精- 伊红染色, × 150)
2 .2 TER试验结果(表 1)

结果显示,化学物腐蚀性强弱与 TER值的改变存在一定相关性,化学物腐蚀性越强,TER 值 降低越明显。异丙醇的染料结合量比阳性对照少,判断为非 腐蚀性,而20%十二烷基硫酸钠( sodium dodecy l su lfate,SDS) 的染料结合量比阳性对照多,判断为腐蚀性。10 种化学物的 TER试验结果与ICCVAM 的TER试验结果一致。

表 1 10种化学物TER试验结果与ICCVAM 的试验结果比较
2. 3 TER 试验与家兔皮肤腐蚀性试验结果比较(表 2 )

两 试验结果具有一致性(M cnemar,P = 0. 500; Kappa= 0. 615,P = 0. 035),2种试验结果差异无统计学意义( F isher' s exac t test, P = 0. 076)。10种化学物中硫酸氢钠和20% SDS 的TER 试 验结果与家兔皮肤腐蚀性试验结果不一致,TER试验将硫酸 氢钠和20% SDS判别为腐蚀性,而动物试验结果判别为非腐蚀性。与动物试验结果比较,TER试验具有高估结果倾向。

表 2 TER 试验与家兔皮肤腐蚀性试验的结果一致性分析
3 讨 论

TER试验原理是腐蚀性化学物作用于离体皮肤后可破 坏角质层,使皮片的屏障功能受损,离子通透性增加,TER 值 下降,因此皮片角质层的完整性是影响屏障功能的关键因 素[3]。对离体皮肤固定装置的评价结果显示,正常大鼠皮片 置于离体皮肤固定装置28 h内其TER值虽略有波动( 10~ 25 k ),但仍在正常皮片的TER 值范围内[5],组织学检查可见 离体大鼠皮片固定24 h时角质层结构仍保持完整,不会对结 果判断造成影响。O liver 等[7]研究认为,离体皮片在48 h内 可保持形态结构完整,表明置于离体皮肤固定装置24 h内的 皮片能维持屏障功能的稳定和皮肤形态结构的完整,可用于 TER试验。

本研究TER试验参照OECD TG430方法进行,对照物结 果均符合文献参考值范围[5]。TER试验与家兔皮肤腐蚀性 试验结果具有较高一致性(M cnema r,P = 0. 500; Kappa= 0. 615,P = 0.035),10种化学物中仅硫酸氢钠和20% SDS 的 TER试验结果与动物试验不同。与动物试验结果比较,TER 试验表现出一定的高估结果倾向。本研究中TER 试验的灵 敏度为100%,特异度为66. 7%,表明TER试验能筛选出绝 大多数具腐蚀性的化学物,可有效地替代家兔皮肤腐蚀性试 验。10种化学物中需要加做硫罗丹明B染料穿透试验的为2 种,且并未对仅用TER 值判断的结果造成影响,因此需增加 更多的化学物来研究该指标的实用性。

TER试验方法作为离体器官模型,具有材料易得、操作简 便、成本低廉等优点,值得推广。但在试验过程中,按OECDTG430要求选用100 H z频率检测TER值时,电桥显示的读数 有时需要经过较长时间才能稳定。有学者认为常规交流电桥 法采用1 000~ 4 000 H z测试频率,能较好地测定电解质溶液 的真实电阻,并有效地避免高频下电感的可能影响[8]。本研 究结果显示1 000 H z检测TER 值时读数较快稳定,且精确度 较高,但读数数值与100 H z的读数绝对值范围不同。OECD TG430中提到检测频率也可选用1 000 H z,然而未提供采用1 000 H z测试频率时的判断标准,因此对于采用不同检测频率 时是否仍能采用相同的结果判断标准还有待进一步研究。

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