中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (5): 572-574   PDF    
引用本文
单晶辉, 王心蕊, 关振宏, 李宁, 宋艳, 张茂林. 小鼠原代神经元细胞狂犬病病毒滴度测定[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(5): 572-574.
SHAN Jing-hui, WANG Xin-rui, GUAN Zhen-hong, et al. Titrating rabies virus in primary cerebral cortex neurons of mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(5): 572-574.
小鼠原代神经元细胞狂犬病病毒滴度测定
单晶辉1,2, 王心蕊1, 关振宏1, 李宁1, 宋艳1,3, 张茂林1     
1. 吉林大学人兽共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室, 吉林长春130062;
2. 吉林大学畜牧兽医学院;
3. 北华大学护理学院
收稿日期: 2010-8-23.
基金项目: 国家科技支撑计划(2008BAB96B11-3);国家自然科学基金(31072147);吉林省科技发展计划重点项目(20080930)
作者简介: 单晶辉(1987- ),女,内蒙古人,硕士在读,研究方向:兽医公共卫生。
通讯联系人: 张茂林,E-mail:zhrei98@163.com
摘要: 目的 探索利用小鼠原代神经元细胞测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的可行性。方法 分离培养小鼠大脑皮质原代神经元细胞,接种100小鼠脑内接种半数致死量(MICLD50)的标准攻击强毒(CVS)毒株,通过免疫荧光和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其感染性,并在此基础上在原代神经元细胞上进行了该毒株的细胞半数感染量(CCID50)测定。结果 成功制备了小鼠大脑皮质原代神经元细胞;原代神经细胞培养物接种CVS 96h后,用抗微管相关蛋白质(MAP2)抗体和抗RV阳性血清作为一抗并经荧光抗体染色后,在胞体和突起上均有神经元特异性和RV特异性着染;在共聚焦显微镜下,当相同的细胞部位上出现红色和绿色交迭时呈现粉色斑点,免疫荧光证实原代神经细胞可被CVS感染,同时RT-PCR得到1 770 bp左右的目的条带,说明其被CVS感染;该原代细胞上所测定的CVS病毒滴度为104.5CCID50/0.1 mL,而该病毒的原始滴度为104.5MICLD50/0.03 mL。结论 小鼠脑原代神经元细胞上测定的CVS株的病毒滴度与通过脑内接种法测定的滴度相同。
关键词: 狂犬病病毒     大脑皮质原代神经元     小鼠脑内接种半数致死量     细胞半数感染量    
Titrating rabies virus in primary cerebral cortex neurons of mice
SHAN Jing-hui, WANG Xin-rui, GUAN Zhen-hong, et al    
Key Laboratory of Zoonosis, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China
Abstract: Objective To explore the feasibility to titrate rabies viruses in prmiary cerebral cortex neurons of mice.Methods The primary cerebral cortex neurons of mice were prepared and inoculated by median mouse intrace rebral lethal dose(100M ICLD50)of CVS stra in and the infections were con firmed by mimuno fluorescent and RT-PCR detection.Then the median cell culture infectious dose(CC ID50)was determined on the cultured neurons.Results The results showed that prmiary cerebral cortexneurons were successfully prepared and could be infected by rabies viruses efficiently.The titer of CVS stra in was 104.5CCID50/0.1mL,and the or iginal inuculum was 104.5MICLD50/0.03mL.Conclusion The titer titrated in the cultured neurons was equal to the original titer of MICLD50.It implies that prmiary cerebral cortex neurons might be served as a potent technique for titrating the rabies viruses in vitro.
Key words: rabies virus     prmiary cerebral cortex neuron     median mouse intracerebral lethal dose     median cell culture infectious dose    

狂犬病( rab ies) 是由狂犬病病毒( rab ie s v irus,RV )引起 的一种高度致死性的人兽共患传染病,造成全球每年超过 55 000人死亡 [1] 。RV 具有高度嗜神经性,在感染者体内多分 布于大脑皮质、海马、小脑等处神经元的胞浆,并形成包涵 体 [2] 。当进行RV 不同毒株间的致病性比较时,需使用相同 病毒滴度的病毒。目前测定RV 活病毒滴度主要采用鼠脑内 接种试验( m ouse ino cula tion tes,t M IT ) 法和细胞培养法。 M IT 法可能因不同毒株对小鼠的毒力不同及鼠的个体差异 而影响测定结果的准确性,而且动物用量大,测定周期长。常 用的细胞培养法具有良好的介质一致性、实验时间短等特点, 但因不同的非神经元性传代细胞株对毒株的敏感性不同而难 以获得准确的结果 [3] 。为此,本研究利用不同RV 株均可感 染神经元的特性,探索是否可在小鼠原代神经元上测定RV 滴度,寻求一种适用于不同RV 毒株毒力测定的方法。

1 材料与方法 1.1 材料

妊娠15~ 18d BALB /c 孕鼠( 吉林大学实验动物 中心,动物合格证号: SCXK- 吉- 2006- 0001) ; 神经细胞培养基和B27无血清培养基添加因子(美国G IBCO 公司); 多聚 赖氨酸(美国S igm a公司); 4 - 羟乙基哌嗪乙磺酸(美国Am resco公司) ; 鼠抗微管相关蛋白质( m icro tubu le -assoc ia ted pro tein 2,MAP2)抗体、吲哚232 菁荧光素( cyan ine dyes 3,CY3) 标记羊抗兔IgG 荧光抗体、异硫氰酸荧光素( fluoresce in isoth iocyanate,FITC) 标记羊抗鼠IgG荧光抗体和辣根过氧化物 酶( horseradish perox idese,HRP) 标记羊抗兔IgG (美国S igm a 公司); 兔抗RV阳性血清(本实验室保存); H ochest 33342( 北 京中科瑞泰公司); TRIzo l试剂(美国Inv itrogen公司); O.lym pus IX81 激光共聚焦显微镜(日本O lym-pus公司)。

1.2 鼠大脑皮质原代神经细胞培养及免疫荧光鉴定

通过 收集胎鼠大脑皮质、分散及培养基筛选等步骤,获得原代培养 物[4,5,6] 。培养7d后参照文献 [7] 进行免疫荧光鉴定。一抗 为鼠抗MAP2抗体1:200倍稀释,二抗为FITC 标记羊抗鼠 IgG荧光抗体1:400倍稀释,H ochest 33342染核。

1.3 原代神经元细胞RV感染和鉴定

分离培养原代神经 细胞,以5. 0×106 个/mL 密度接到6 孔板,7 d后每孔接种 100小鼠脑内接种半数致死量(M ICLD50 ) 的标准攻击强毒 ( CVS)株,于37℃、5% CO2 下继续培养96h 后,分别进行间 接免疫荧光 [7] 和逆转录- 聚合酶链反应( RT PCR) 检测。间 接免疫荧光检测中一抗为1:100 倍稀释的兔抗RV 阳性血清 及1: 200倍稀释的鼠抗MAP2抗体进行,二抗为1:400倍稀 释的CY3标记羊抗兔IgG 和1 400倍稀释的FITC 标记羊抗 鼠IgG,H ochest 33342染核。RT PCR 检测过程中,以感染细胞总RNA 为模板,用随机引物合成cDNA 后,以G1( + ) 序 列: ( 3221 ) 5' CGCTGCATTTYATCAAAGTCAAG 3 ( 3243 ) 和 G2 (-) 序列: ( 4979 5'-TGMAYGGAGTTCAAGGAGGAC-3' ( 4999)引物进行扩增,电泳检测片段大小。

1.4 CVS 株在原代神经元细胞上的CC ID50测定

分离培养 原代神经细胞,在96孔板上,将以5.0×105 个/mL 密度接 种、培养7 d的原代神经元细胞吸弃上清,加入10 倍系列稀 释的、原始滴度为104. 5M ICLD50 /0.03 mL的CVS,置于CO2 培 养箱中培养96 h。经反复冻融后包被,用间接EL ISA 检测。 一抗为1:100倍稀释的兔抗RV 阳性血清,二抗为1:10 000倍 稀释的HRP标记山羊抗兔IgG。根据不同稀释度的感染率, 按Spea rm an K rber法计算细胞半数感染量( CC ID50 ) [8] 。

2 结 果 2.1 大脑皮质原代神经细胞的培养及免疫荧光鉴定

镜下 可见成簇和散在的细胞,胞体上发出纤细的突起,具典型的神 经元外观。通过H ochest 33342着染,胞核呈蓝色(图 1); 经 抗MAP2抗体染色,视野中所有细胞从胞体至突起均呈绿色, 并有多个细胞发出的突起部分连接在一起(图 2)。

图 1 H ochest33342 染神经元

图 2 神经元细胞特异染色
2.2 原代神经元细胞的RV感染和鉴定 2.2.1 免疫荧光染色

原代神经细胞培养物接种CVS 株 96 h后,用抗MAP2抗体和抗RV 阳性血清作为一抗并经荧 光抗体染色后,在胞体和突起上均有神经元特异性和RV 特 异性着染(图 2和3)。在共聚焦显微镜下,当相同的细胞部 位上出现红色和绿色交迭时呈现粉色斑点。这类斑点主要分 布在胞体,在突起上也有散在分布(图 4)。

图 3 RV特异性染色

图 4 激光共聚焦合并图
2.1.2 RT PCR 结果( 图 5)

从CVS 感染的神经元中提取核酸经RT PCR 扩增,电泳显示,有与预期结果一致的1 770 bp条带。

图 5 RT-PCR 产物电泳图
注: G: 扩增产物; M: DL2000M ark er。
2.3 CVS 株在原代神经元细胞上的CC ID50

测定 用spearm an-Kärbe r法计算的滴度为104. 5 CC ID50 /0.1 mL。

3 讨 论

RV主要侵袭神经系统,尽管RV不同毒株对非神经元传 代细胞的亲嗜力不同,但无论强毒株还是弱毒株,均可感染神 经元 [9] 。微孔板培养法已广泛用于病毒滴定。本研究按常 规方法进行CVS株的病毒滴度测定,在细胞病变法不能有效 判定CVS株病毒滴度的前提下,对处于微孔板上的感染细 胞,经过多次冻融后,加入包被液使病毒吸附到培养板上,通 过对间接ELISA 结果计算得出该病毒的CC ID50 为104. 5 / 0.1mL。从数值上看其与脑内滴度测定数值相同,表明原代 神经元细胞可用于CVS 株的滴度测定。将该数值换算成相 同体积时,微孔板测定的CVS株的CC ID50为104.023 /0.03 mL, 低于脑内接种的测定值,初步显示该方法可能不及M IT法敏 感,而与本实验中所用的CVS株在幼仓鼠肾细胞系基本检测 不到明显增殖相比,原代神经元确实较传代的非神经元细胞 更灵敏。考虑到本实验中所用毒株数量较少,其对M IT法是 否具有替代性等还需大量实验验证。

参考文献
[1] 罗明,张茂林,涂长春.我国狂犬病流行状况分析及防治对策[J].中国人兽共患病杂志,2005,21(2):188-190.
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