伏马毒素是20世纪80年代末期发现的一类由串珠镰刀 菌( Fusar ium m oniliform Sheldon) 产生的真菌毒素,主要存在 于谷物中,以玉米居多。伏马毒素与马脑白质软化症、猪肺水 肿症侯群以及人类食道癌等人畜疾病有关。化学发光酶免疫 测定( chem ilum inescent enzym e immunoasssay,CLE IA ) 属于酶 免疫测定,通过加入增强剂以增强发光和延长发光时间的增 强化学发光反应( enhanced chem ilum inescence,ECL),比传统 的酶联免疫吸附分析( enzym e-linked immunoso rbent assay, ELISA)具有更高的灵敏度,且检测所需时间短、费用低。本 研究以辣根过氧化物酶标记伏马毒素B1 ( FB₁ )半抗原,以鲁 米诺作为酶作用底物,同时以对碘酚为反应体系增强剂,将增 强化学发光酶免疫技术( ECL-ELISA)应用于谷物中的伏马毒 素快速检测。

荧光/化学发光仪( 美国Therm o公司); 高 效液相色谱仪( LC-10ATVP,日本岛津公司) 配Sh im adzu CLASS-VP工作站和Shim adzu RF-10AXL检测器。FB₁ 多克 隆抗体(农业部食品营养与安全重点实验室); 伏马毒素B1 ( 纯度98% ),钥孔嘁血蓝蛋白( KLH )、3,3' ,5,5'-四甲基联苯 胺( TMB,色谱纯)、过氧化氢脲( CH₆N₂O₃,色谱纯) 、辣根过 氧化氢酶( HRP) ( 美国S igm a 公司); 鲁米诺( lum ino ,l 色谱 纯) 、对碘酚( p- iodopheno l)、牛血清白蛋白( BSA )、卵白蛋白 ( OVA) (德国M e rck公司),其他药品均为分析纯。

包被抗原( FB₁-OVA) 的 制备采用戊二醛2 步法; 酶标抗原( FB₁ -HRP) 的联结采用高 碘酸盐法。

对于ECL-ELISA,所需优化的参数有包被抗体量、酶标稀释缓 冲液和酶标稀释比例、竞争反应时间等。以最大相对发光单 位/半数抑制浓度( RLU_max / IC₅₀ )的比值作为评价各参数的标 准,比值越大则代表灵敏度越高。

用包被液稀释FB₁ 抗体至所 需浓度,包被于96孔板中,100 μL /孔,室温包被过夜。次日 用洗液洗板3次,然后加入1% BSA 封闭液,200 μL /孔室温 封闭1 h。100 μL FB₁ 标样或稀释后的样品萃取液和100 μL FB₁-HRP加入到抗体包被的孔中,室温竞争反应1 h。用洗液 洗板3次,将96孔板置于荧光/化学发光仪中,设定相应程 序,向每孔中加入150 μL 底物溶液( 1.0 mm o l/L 鲁米诺, 1.25 mm o l/L对碘酚和1. 0 mmo l/L H ₂O₂ ),并于加入底物溶 液后30 s立即测定各孔的相对发光强度。

在FB₁ 的实际样品检 测中,甲醇( 70% ~ 80%,v / v)和乙腈( 50% ,v /v) 是最常用的 2种萃取用有机溶剂,试验分别比较了2种有机溶剂在5%、 10%、20%和40%浓度时对ECL-ELISA 的RLU以及检测灵敏 度的影响。

分别取玉米、大麦、燕麦、花 生、大米和黄米样品各10 g 为加标样品,经高效液相色谱 ( HPLC)检测不含有FB₁,向其中添加不同浓度的FB₁ 标准 品,室温静置过夜。加标样品的萃取、净化处理和高效液相色 谱分析方法参照文献^[1]。

实验分别比较了不同的抗体包被 量( 0. 5、1.0、1. 5和2.0 μg /孔) 对反应灵敏度及化学发光强 度的影响,固定酶标抗原稀释比例为1:100 000。从RLU_max / IC₅₀最大比值看,0. 5和1. 0 μg /孔> 1. 5和2.0 μg /孔,但前 两者差别较小,从节约抗体用量的角度考虑,试验最终选择 0.5 μg /孔的包被量。

对4种酶标稀释缓冲液: 磷酸盐缓冲液( PBS) ,pH 7.4、磷酸盐吐温缓冲液( PBST ),含 0.5% T ris、0. 5% BSA /PBS ( W /V ) 和0.5% BSA /PBST (W /V)进行比较,相同条件下,加入BSA 可以使发光强度明 显增强。使用0. 5% BSA /PBS 做酶标稀释液,其RLUma x最 大; 但是0.5% BSA /PBST 可以使反应的RLU_max / IC₅₀ 最大,因 此最终确定选用0. 5% BSA /PBST 作为酶标稀释缓冲液。

酶标浓度 对反应的灵敏度具有重要影响。在一定酶标浓度范围内,酶 标浓度过高,会使反应灵敏度降低; 当浓度过低时,又会使催 化作用减弱,从而导致反应的发光强度降低。实验分别考察 了不同酶标稀释比例对反应灵敏度的影响,随酶标稀释比例 不断增加,反应曲线的IC₅₀值明显下降,而RLU_max也在不断降 低。当酶标浓度在1:100 000时,RLU_max / IC₅₀最大,因此选择 酶标稀释比例为1:100 000进行以下实验。

随反应时间延长,其最大相对发 光强度明显增加,到60 m in时达到5. 89,几乎是15 m in反应 的3倍; IC₅₀也有随时间延长而下降的趋势,60 m in 时最低,为 0.042 μg /L,且60 m in反应使RLU_max / IC₅₀值最大,实验选定竞 争反应时间为60 m in。按照上述优化好的参数,以直接竞争 ELISA法,得到不同FB₁浓度的相对发光值,根据相对发光值计 算抑制率,得到该方法对FB₁ 的检测灵敏度IC₅₀ 为( 0.41± 0.04) ±g /L,最低检测限( LOD) 为( 0.11±0. 05) μg /L,完成 整个检测所需时间约为70 m in。

毒素萃取中, 常用的有机溶剂为75%甲醇和50%乙腈,以PBS代替有机溶 剂作为标准参照,不同浓度的甲醇和乙腈对ECL-ELISA 的影 响结果如图 1,2 所示。各浓度的2 种有机溶剂对于ECL- ELISA的相对发光强度无明显影响。由图 1可见,5%和10% 的甲醇对ECL-ELISA几乎无影响,2 条曲线与PBS 的标准曲 线非常接近; 当甲醇浓度> 20%时,IC₅₀迅速提高,到40%时, IC₅₀达1.52 μg /L,曲线已不再呈S型。图 2则表明乙腈浓度 ＜ 5%时对ECL-EL -ISA 影响较小,IC₅₀与PBS 曲线相差不大; 随浓度增大,IC₅₀值持续增加,至40%时IC₅₀几乎为PBS 标准 曲线的2倍。表明乙腈对ECL-ELISA 的影响要大于甲醇,因 此在谷物类样品处理中,采用甲醇作为萃取溶剂,并在ELISA 检测时将甲醇浓度稀释至≤ 10%。

图 1

Fig. 1

图 1 甲醇对ECL-ELISA影响

图 2

Fig. 2

图 2 乙腈对ECL-ELISA影响

取6个不同浓度的FB₁标准溶 液进行ELISA分析,每个浓度作6次重复,对于建立的化学发 光酶免疫ELISA方法进行精密度测试。ECL-ELISA 对FB₁各 浓度的板内变异系数＜ 5. 05%,板间变异系数＜ 12. 84%,表 明该ELISA方法具有较高的精密度。

向6种谷物样品中分别 添加3 个浓度水平的FB₁,经甲醇萃取及掩蔽剂稀释后,用 ECL EL ISA测定回收率。结果表明,在100~ 500 μg /kg的加 标水平上,ECL-ELISA 的平均回收率为72. 61% ~ 115. 44%, 变异系数为6. 44% ~ 24. 50%。另外单独选择玉米样品加标 FB₁ 标准品,在250~ 1 000 μg /kg 的加标水平上,用HPLC 考 察ECL-ELISA 的准确性,两者测定结果相关系数R 为0. 99, 说明所开发的ECL-ELISA 和HPLC的检测结果具有较高的相 关性。

表 1 (Table 1)

表 1 6种谷物样品FB1加标回收结果 样品 加标水平(μg/kg) ECL-ELISA检测结果(n=3) 回收结果(μg/kg) 回收率(%) CV(%) 玉米 100.00 75.63 75.63 14.62 250.00 272.04 108.82 14.55 500.00 481.13 96.23 10.14 大米 100.00 108.21 108.21 17.43 250.00 279.88 111.95 8.03 500.00 543.62 108.72 6.44 大麦 100.00 115.44 115.44 17.68 250.00 242.07 96.83 11.09 500.00 488.94 97.79 13.92 燕麦 100.00 113.89 113.89 14.10 250.00 246.11 98.44 7.33 500.00 518.30 103.66 14.61 花生 100.00 77.58 77.58 21.52 250.00 264.75 105.90 24.50 500.00 484.05 96.81 10.08 黄米 100.00 72.61 72.61 21.67 250.00 232.41 92.96 11.14 500.00 478.09 95.62 15.90

表 1 6种谷物样品FB1加标回收结果

表 2 (Table 2)

表 2 ECL-ELISA 和HPLC加标回收结果比较( n= 3) 玉米样品 加标水平(μg/kg) ECL-ELISA结果(μg/kg) HPLC结果(μg/kg) ELISA/HPLC(%) 1 250.00 267.87 239.91 111.65 2 500.00 521.13 485.38 107.37 3 800.00 860.37 778.02 110.58 4 1000.00 1119.56 973.64 114.99

表 2 ECL-ELISA 和HPLC加标回收结果比较( n= 3)

对伏马毒素的痕量检测,国内外应用较早的主要为高效液 相色谱等仪器分析方法。仪器检测虽然具有较高的灵敏度,但 是其样品前处理过程繁琐,通常需要专业人员进行操作,检测 过程耗时且费用较高,不适于大量样品的现场快速检测。

ELISA 的技术条件要求低、携带方便,常以试剂盒的形式 出现且易商品化,操作简便、经济实惠,对样品纯度要求不高, 因此已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与 分析技术,并在近十几年得到迅速发展。自1992年Azcona O livera等人首次制备出伏马毒素B1抗体并应用ELISA 方法 检测伏马毒素以来,许多学者也陆续进行了相应地深入研究, 但多为传统的颜色反应( co lor im etr ic detection) 方法,对FB₁的 最低检测限为0. 62 μg /L^{[2, 3, 4, 5, 6, 7]}。本研究开发的多克隆抗体基 础上的增强化学发光酶免疫法检测谷物中的伏马毒素B1,其 最低检测限为0. 11 μg /L,样品前处理简单,只需简单稀释即 可,其完成整个检测时间仅为70 m in。对加标玉米样品的 ECL-EL ISA和HPLC分析结果表明,ECL-ELISA和H PLC 具有 较高的相关性,说明所开发的化学发光酶免疫ELISA 方法可 以用于谷物样品中FB₁的筛选及定量分析。