2011, Vol. 27
腰果( cashew,Ana ca rdium o ccidenta le L. ) 是世界四大干 果之一,广泛用于各类食品,是引起食物过敏主要因素之一, 占坚果类引发过敏的20% [1]。食品过敏原严重危害致敏人 群健康,甚至危及生命[2]。预防食品过敏最有效手段是食品 过敏原检测。目前,腰果过敏原PCR 检测方法国内报道较 少,国外少量腰果检测试剂盒昂贵、特异性差与其他坚果交叉 反应、灵敏度低等缺点限制其广泛应用[3]。本研究旨在建立 一种廉价、快速、高灵敏度腰果过敏原PCR 检测方法。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料腰果、杏仁、开心果、花生、巴西坚果、长寿果、 核桃、瓜子、山核桃、榛果、松子、芝麻、大麦样品均购自超市。
1.1.2 仪器离心机; 旋涡振荡器; 恒温箱; 核酸蛋白分析仪 ( 美国B IO-RAD公司); 普通PCR扩增仪( 德国Eppendorf公 司) ; DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂); Genius凝胶成像仪 ( 美国Gene公司) 。
1.1.3 试剂Taq酶、dNTPs、10 × PCR 缓冲液、溴化乙锭、相 对分子质量标记( 2 000 bp) (大连宝生物公司); 琼脂糖( 电 泳纯) 、三羟甲基氨基甲烷( Tris) 饱和酚/氯仿(体积比25. 24) ( 上海生工公司); 无水乙醇、异丙醇(北京六合通公司); 氯 仿/异戊醇(体积比24: 1,本实验室配制); 溴化十六烷三甲基 胺( CTAB) 核酸裂解液: 100 mm o l/L Tris-HC ,l 50 mmo l/L 乙二 胺四乙酸二钠盐( EDTA),1. 4 m o l/L NaC ,l 体积分数2% 聚乙 烯吡咯烷酮( PVP),pH 8. 0; DNA 提取试剂盒: W izardM agne t- ic DNA Pur ification fo r Food (美国Prom ega公司)。 1.2 方法 1.2.1 DNA提取
( 1) 溴化十六烷三甲基胺( CTAB) 提取 法[4]。( 2) 磁珠法[5]。
1.2.2 引物设计及筛选( 1)引物设计: 利用美国Prim er express 3. 0软件针对3种腰果主要致敏蛋白基因序列( AnaO1、 AnaO2、AnaO3),设计9 对引物,植物通用引物Plant159来自 本实验室。引物均由上海英骏技术公司合成。( 2) 引物筛 选: 通过腰果扩增效果确定扩增最佳退火温度、初筛引物; 通 过腰果等8种坚果扩增的特异性结果筛选最佳引物AnaO3 F3: TACTCCTCCTATCTGCCTTCG AnaO3 R3: CC TCCTCACCCTTTATTTGT,312 bp。
1.2.3 PCR 扩增条件优化以腰果DNA为模板,以上述筛选 出的最佳引物进行退火温度优化,以找到该引物最佳退火温度。 PCR反应体系: DNA模板5 μL(约50 ng); 10 × PCR反应缓冲液 2. 5 μL; dNTPs 0. 5 μL; 上、下游引物( 10 μm ol/L)各0. 5 μL; Taq DNA聚合酶0. 2 μL,用无菌水补至总体积为25 μL。扩增条件同 1. 2. 2。采用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
1.2.4 特异性实验以腰果、杏仁、开心果等13种坚果DNA 为模板,进行双重PCR 扩增,分析该检测方法特异性。以上 述筛选出的最佳引物对为腰果特异性扩增引物; 以植物通用 扩增引物对P lant 159F,Plant 159R 为内参照,确证坚果DNA 的有效提取。设置空白对照。双重PCR反应体系: DNA 模板5 μL( 约50 ng ); 10 × PCR 反应缓冲液2. 5 μL; dNTPs 0. 5μL; 两对上、下游引物( 10 μmo l/L) 各0. 5 μL; Taq DNA聚合 酶0. 2 μL,用无菌水补至总体积为25 μL。扩增条件为: 94 ℃ ,5 m in; 94 ℃ ,30 s,55 ℃ ,30 s,72 ℃ ,30 s,35个循环; 72 ℃ ,5 m in; 4 ℃ ,保存。采用2% 琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结 果。
1.2.5 灵敏度实验用紫外分光光度仪测定腰果DNA 浓 度,用无菌去离子水将DNA 溶液稀释成质量浓度分别为10、1 ng /μL,100、10、1 pg /μL的溶液,分别取5 μL进行普通PCR扩增。反应体系同1. 2. 4,扩增条件为: 94 ℃ ,5 m in; 94 ℃ , 30 s,55. 4 ℃ ,30 s,72 ℃ ,30 s,35个循环; 72 ℃ ,5 m in; 4 ℃ , 保存。采用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果。
1.2.6 样品添加实验分别称取研磨后腰果样品、大麦样品 0. 5 g放入1. 5 mL 离心管中,加入1 mL 核酸裂解液,放入 65 ℃ 水浴,恒温振荡2 h后,将一定体积腰果溶液与一定体积 大麦溶液混和,配制成含有10%、5%、1%、0. 5%、0. 1%、 0. 05%、0. 01%、0. 001%和0. 000 1%腰果成分的样品溶液, 采用磁珠法提取DNA,分别取5 μL进行普通PCR 扩增。方 法同1. 2. 5。采用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果。
2 结 果 2.1 DNA提取质量分析(表 1)分别取CTAB法和磁珠法提取 DNA样品10 μL加90 μL无菌水稀释10倍后,检测260 nm 和 280 nm 下的A值。DNA 纯度以A260 /A280比值判断,DNA 浓度 以A260值计算[6]。从表 1可见,CTAB法提取DNA A260 /A280比值普遍＜ 1. 8,说明有蛋白质污染; 磁珠法提取DNA A260 /A280 比值为1. 863 3~ 2. 004 1,说明蛋白质去除比较干净,符合 PCR检测要求。故采用磁珠法提取坚果DNA。
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表 1 采用CTAB法、磁珠法提取坚果DNA结果 |
以腰果DNA (浓度为10 ng /μL)为模板, 依次以引物对AnaO1 F1R1、AnaO1 F2R2、AnaO1 F3R3、AnaO2 F1R1、AnaO2 F2R2、AnaO2 F3R3、AnaO3 F1R1、AnaO3 F2R2、 AnaO3 F3R3进行温度梯度PCR 扩增。选择退火温度较高、 扩增条带清晰且无非特异性条带、无引物二聚体的引物对。 初步筛选出4 对引物,AnaO1 F2R2、AnaO2 F2R2、AnaO3 F1R1、AnaO3 F3R3,其最佳退火温度分别为55. 9 ℃ 、 55. 9 ℃ 、55. 4 ℃ 、55. 4 ℃ 。
2.2.2 最佳引物确定(图 1)分别以腰果和容易与腰果发 生交叉反应的开心果、杏仁、花生、核桃、瓜子、芝麻、榛果等坚 果的DNA为模板,以上述筛选出的4 对引物对为扩增引物, 进行普通PCR扩增。从图 1可见,4种引物对均扩增出了腰 果的特异性条带。但是引物对AnaO1 F2R2还扩增出了开心 果和芝麻; 引物对AnaO2 F2R2还扩增出了开心果,且榛果和 瓜子在1 068 bp附近也有扩增; 引物对AnaO3 F1R1 还扩增 出了开心果和花生; 引物对AnaO3 F3R3 只扩增出腰果。结 果表明,引物对AnaO3 F3R3(以下称AnaO3 FR)特异性最好, 确定为最佳引物对。
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注: M: DNA m arker; 1: 腰果; 2: 开心果; 3: 杏仁; 4: 花生; 5: 核桃; 6: 瓜子; 7: 芝麻; 8: 榛果; 9: 山核桃。 图 1 最佳引物筛选结果 |
以腰果DNA 为模板,分析腰果 特异性引物AnaO3 FR 在不同退火温度下的扩增情况,优化 PCR扩增条件。结果表明,退火温度为55. 4 ℃ 时能从样品中 扩增出明亮清晰的条带,且无拖尾,无非特异性条带和引物二 聚体,从而确定最佳退火温度为55. 4 ℃ 。
2.3 方法特异性分析(图 2)为确定上述方法的特异性,采用 上述方法,并采用植物通用引物对Plant 159为内标,对腰果、杏 仁、开心果等13种坚果DNA进行双重PCR。从图 2可见,除空 白对照外,所有坚果均清晰地扩增出159 bp的内标条带,而只有 腰果样品能扩增出312 bp的特异性条带。结果表明,该方法与 其他坚果样品不存在交叉反应,具有很好的特异性。
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注: M: DNA m arker; 1: 腰果; 2: 杏仁; 3: 开心果; 4: 花生; 5: 巴西坚 果; 6: 长寿果; 7: 核桃; 8: 瓜子; 9: 山核桃; 10: 榛果; 11: 松子; 12: 芝麻; 13: 大麦; 14: 空白对照。 图 2 方法特异性分析结果 |
图 3可见,采用该方法检测腰 果DNA梯度稀释溶液,能检测到含量为0. 1 pg /μL的腰果 DNA成分。结果表明,该PCR法检测腰果过敏原成分的灵敏 度为0. 1 pg /μL。
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注: M: DNA m arker; 1: 10 ng /μL; 2: 1 ng /μL; 3: 100 pg /μL; 4: 10 pg /μL; 5: 1 pg /μL; 6: 0. 1 pg /μL; 7: 空白对照。 图 3 方法灵敏度结果 |
将腰果粉按一定比例添加 到大麦粉中,制成含有腰果成分的食品样品,模拟食品样品中 腰果成分检测。结果表明,该PCR 方法可以检出食品中> 0. 001% 的腰果成分。
3 讨 论国内外有关腰果致敏蛋白检测的报道不多,主要为13S 球蛋白(豆球蛋白族)和2S白蛋白[7, 8]。目前确定序列的只 有3种蛋白AnaO1、AnaO2、AnaO3。其中AnaO1是腰果的一 种主要致敏蛋白,约50 kd,类似于花生的主要致敏蛋白花生 豌豆球蛋白,但抗原表位与花生不同[9]。AnaO2是腰果的一 种类似于豆球蛋白的主要致敏蛋白,天然的AnaO2 蛋白包括 一个主要的33 kd条带和一个次要的53 kd条带,与大豆球蛋 白表位有相似也有不同。AnaO3 是腰果的一种主要2S白蛋 白致敏蛋白,天然AnaO3蛋白大小约为12. 6 kd,由3个大小 为6~ 10 kd的亚基组成,与胡桃2S白蛋白表位相似[10]。本 文根据3种AnaO基因设计引物,通过对杏仁、开心果、花生 等多种坚果成分的特异性筛选,确定AnaO3的腰果特异性扩 增引物AnaO3 FR,建立了检测方法。 本研究建立的腰果PCR 方法特异性好,与其他12种坚 果不发生交叉反应,包括其他试剂盒中易发生交叉的开心果、 芝麻、花生等; 建立的方法灵敏度高,达0. 1 pg /μL。
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