白斑综合症病毒( white spot syndrom icvirus,WSSV ) 是 对虾养殖中危害最严重的病原。该病毒传染力强、致死率高、 流行范围广,给全球对虾养殖业造成了巨大损失。自W SSV 首次爆发以来,至今仍未能有效控制该病毒病的发生与发 展^[1]。W SSV 的极早期基因IE1是在病毒感染的极早期,在 无病毒DNA 复制,无新病毒蛋白合成的情况下,被宿主细胞 中的“ 转录机器”启动,并利用宿主细胞RNA 聚合酶II 进行 转录的基因,其表达蛋白在病毒复制过程中对病毒自身和宿 主细胞起着非常重要的调节作用^[2]。本研究在已知W SSV 极早期基因IE1全长序列基础上,对该基因进行原核表达、纯 化和鉴定,以期获得有生物学活性的重组蛋白,为进一步功能 研究奠定基础。

日本对虾( 厦门第八市场),平均体重20~ 25 g,20尾/箱养于30 L塑料水族箱内,用拷贝数为3 × 10⁶ 病 毒滤液在对虾的第4 尾节的侧腹部注射感染。质粒pGEX- 4T-2和大肠埃希菌BL21( DE3) (海洋三所生物重点实验室) 。 引物设计: IE1F: CGGAATTCATGGCCTTTAATTTTGAAGACTC ( 下划线为E coR I 酶切位点),IE1R: AAGTCGACCCTTATA- CAAAGAATCCAGAAATCTC (下划线为Sal I 酶切位点) ( 上 海Inv itrogen公司)。

Taq酶、dNTP、限制性内切酶E coR I、 Sal I、T4 DNA 连接酶及M a rker DL2000( 大连T aRaKa公司); 质粒提取、凝胶回收试剂盒(美国Om ega 公司)、十二烷基硫 酸钠( SDS)、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、二硫苏糖醇 ( DTT)、异丙基-D 硫代半乳糖苷( IPTG ) (上海生工生物工 程公司); 聚醚二砜膜( PVDF) (美国M illipo re 公司); 谷胱甘 肽Sepha rose 4B 亲和层析柱胶及空柱(美国通用医疗技术公 司); 小鼠抗谷胱甘肽硫转移酶( GST) 单克隆抗体、3,3'- 二 氨基联苯胺( DAB)、羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP) 标记二 抗(北京天根生化科技有限公司)。基因扩增仪(德国Eppen- do rf公司); 紫外分光光度仪( 上海尤尼柯仪器有限公司); 电 泳仪和电泳槽(美国B IO-RAD公司)。 1.3 方法 1.3.1 IE1基因扩增

取10 mg 对虾心脏组织,制备PCR 模 板,方法按文献^[3]。以引物IE1F和IE1R扩增WSSV 病毒 IE1序列。循环条件为: 94 ℃ 预变性3 m in,94 ℃ 变性30 s, 53 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,35个循环,72 ℃ 延伸7 m in。琼 脂糖凝胶电泳检测并利用紫外分光光度计检测其纯度和含量。

E coR I及Sal I对PCR产物和载 体pGEX-4T-2分别进行双酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳分离 回收,将DNA 片断用T4 DNA连接酶在16 ℃ 连接过夜,连接 反应液转化感受态E. coliBL21。通过氨苄青霉素平板抗性筛 选,克隆进行质粒提纯,双酶切电泳及DNA 测序鉴定得到正 确的pGEX-4T-2-IE1融合表达载体。

取50 μL培养过 夜的阳性克隆菌液,加入含有氨苄的5 mL琼脂糖培养基中, 37 ℃ ,220 r /m in,震荡培养3 h,当菌浓度A550值为0. 5~ 1. 0 之间时,加入IPTG 至终浓度1 mmo l/L 诱导表达5 h,离心收 集菌体,进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE ) 分析。 参照Sepharo se 4B说明书进行蛋白纯化。

将聚丙烯酰 胺凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上,5%脱脂牛奶液4 ℃ 孵育 12 h,抗鼠GST抗体为一抗(稀释比1:1 000) 室温孵育1 h,辣 根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(稀释比1:500)室温孵育1 h, 二氨基联苯胺( DAB) 显色至出现目的条带,超纯水终止反应。

以感染WSSV 病毒的对虾 基因组DNA 为模板,扩增IE1基因片段预计长度约为718 bp,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,在约700 bp区域可 见1条特异性条带,证明PCR成功。

图 1

Fig. 1

注: 1: M ark er DL2000; 2: PCR 扩增产物; 3: 阴性对照。 图 1 PCR 扩增IE1基因

将PCR扩增产物插 入到质粒pGEX-4T-2 构建pGEX-4T-2-IE1 重组质粒. 构建的 重组质粒双酶切后在1% 琼脂糖凝胶电泳结果显示,在 700 bp 有一清晰条带,与目的基因的大小基本相符,表明重 组质粒构建成功。

图 2

Fig. 2

注: 1: M ark er DL2 000; 2: E coR I/Sa l I双酶切pGEX-4T-2-IE1质粒。 图 2 重组质粒双酶切鉴定

用12% SDS-PAGE电泳检测表达产物,发现pGEX-4T-2-IE1 /BL21 诱 导后增加1条大小约51 kDa的新生蛋白条带,与预计表达蛋 白大小相符合。为获得最优蛋白表达条件,采用17 ℃ ,27 ℃ 和37 ℃ 的温度梯度对融合蛋白进行诱导,纯化后电泳分析, 发现17 ℃ 条件下融合蛋白浓度和纯度均较为理想。

图 3

Fig. 3

注: 1: 蛋白m arker; 2~ 4: pGEX-4T-2-IE1未诱导、诱导后、可溶性上清; 5: 纯化GST-IE 1蛋白; 6 ~ 8: pGEX-4T-2未诱导、诱导后、 可溶性上清; 9: 纯化GST 蛋白。 图 3 pGEX-4T-2-IE1蛋白诱导表达

GST特异性单克隆抗体可识别出特 异性条带,GST为26 kDa,GST-IE1融合基因表达产物的片段 为51 kDa,带有GST抗原识别性,其分子量与GST蛋白相比, 大约相差约25 kDa。

研究人员用放线菌酮抑制了W SSV感染对虾体内新生蛋 白质合成,然后利用WSSV 病毒开放阅读框微阵列筛选出60 个候选极早期基因,进而通过反转录确认了其中3个极早期 基因IE1、IE2和IE3。用绿色荧光蛋白为报告基因进行启动 子活性分析显示,IE1 启动子为强启动子^[3]。该启动子中包 含了1个转录激活因子( STAT) 结合位点,凝胶阻滞电泳分析 证实,STAT能与IE1的启动子结合。而且,W SSV 感染草虾 细胞内STAT 活性高于未感染W SSV 的草虾。此外,其他研 究也证实该启动子有较强的转录活性^{[4, 5, 6]}。 从分子水平开展WSSV 极早期蛋白的功能研究,有助于 了解病毒发生与发展过程,为对虾病害防治方法的建立提供 借鉴。以往对W SSV极早期蛋白的研究都集中在筛选鉴定和 启动子活性上。本实验中,采用高效GST 融合表达载体 pGEX-4T-2,该载体表达产品可通过亲和层析法纯化,操作简 单,用凝血酶即可进行酶切除去GST,进而获得所需要的蛋白 产品^{[7, 8]}。在蛋白大量表达前优化蛋白表达条件,发现在17 ℃ 温度下诱导获得的蛋白产量和纯度较高。通过western b lo t 证实获得了分子量约为51 kDa 的融合蛋白。为进一步研究 该蛋白在W SSV侵染过程中的作用提供了依据。