多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，PM) 是一种重要的畜、禽、野生动物及人类共患性病原菌。由该菌引起的兔巴氏杆菌病传播快、病程急、发病率和死亡率高，对养兔业危害非常大^〔1〕，同时也会影响到人类的生命健康和安全。该病传统的实验室检测方法(病原分离与生化鉴定等) 繁杂费时，且检出率较低; 一些酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) ，均存在步骤繁多、敏感性较低等不足^{〔2, 3〕}。因此，寻找一种快速、特异的病原体检测方法很有必要。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)^〔4〕具有快速、敏感性高、特异性强、重复性好、易于标化和操作等优点，应用于细菌、病毒病的诊断及检测已有较多的报道^{〔5, 6, 7〕}。 本试验在对兔多杀性巴氏杆菌研究基础上，建立了兔多杀性巴氏杆菌的PCR 检测方法并进行了优化，以期为兔巴氏杆菌病的快速检测与诊断提供一定的技术支持。

兔血清A 型标准菌株C 51-17，禽血清A 型标准株C 48-1(中国兽药监察所) 。兔链球菌(rabbit S.pneumoniae) 、兔支气管败血性波氏杆菌(Rabbit B.bronchiseptica) 、 兔大肠杆菌(Rabbit E.coli) 和兔葡萄球菌(rabbit Staphylococcus aureus) 为本实验室分离鉴定保存。

10 × PCR reaction buffer，三磷酸脱氧核糖核苷 (deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs) ，rTaq 酶，6 × Loading buffer 和2 000 bp DNA Marker 等(大连宝生物工程有限公司) ; 琼脂糖，Tris-Cl，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA) 等(上海生工生物技术有限公司) 。

以Genbank 中多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白H(outer membrane protein H，OmpH) 基因序列为模板，用primer primer 5.0 软件设计一对引物，P1: 5'-GGGTGAAGTGAGAAATAGAGGC - 3'，P 2: 5'-CCACTAATCACCGCGCTC - 3'，扩增目的片段长度是526 bp，由上海生工生物技术有限公司合成。

兔巴氏杆菌DNA 的提取: 将菌株分别接种于马丁肉汤，37 ℃培养18 ～ 20 h，离心沉淀菌体，用磷酸盐缓冲液离心洗涤2 次，沉淀菌体并加入适量的三羟甲基氨基甲烷－乙二胺乙酸二纳缓冲液制成菌体悬浮液，参照文献〔8〕中方法提取DNA 并测定核酸浓度及纯度，保存于-20℃冰箱备用。

采用25 μL 反应体系: dNTPs(2.5 mmol /L) 2 μL; 引物P 1、P 2 (20 pmol /μL) 各 1 μL; rTaq 酶(5 U/μL) 0.5 μL; 模板DNA 1 μL; ddH2O 17.0 μL。反应程序为: 95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min; 53 ℃ 退火1 min; 72 ℃ 延伸1 min; 30 个循环; 72 ℃延伸10 min。 PCR 反应结束后，取10 μL PCR 产物于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳。

对兔常见的4 种呼吸道病原菌——— 兔链球菌、兔支气管败血性波氏杆菌、兔大肠杆菌和兔葡萄球菌的DNA 进行PCR 扩增，同时设阴性对照和阳性对照。

对引物浓度、rTaq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、退火温度及模板浓度(PCR 敏感性) 等反应条件的优化，均是在某项成分变化，其他成分不变的情况下，按照1.5 的反应体系及反应程序进行扩增，扩增的模板为 1.4 方法中获得的DNA，扩增后直接电泳观察结果。

将提纯的标准株C 51-17 的DNA，经紫外分光光度计测定其纯度和浓度，调整其浓度后再作连续稀释，即1 μg，500、250、100、10、1 ng，100、10、1 pg，500、100 fg 分别作为模板DNA 进行PCR 检测。

对实验室保存的30 份兔巴氏杆菌病疑似病料(临床上呈现肺炎症状或出血性败血症) ，用本试验优化建立的PCR 反应体系进行检测; 同时用传统方法进行病原分离与生化鉴定: 凡是麦康凯培养基上不生长，能发酵葡萄糖、果糖、甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸盐还原试验阳性，甲基红(methyl red，MR) 、V-P 试验 (Voges-Proskauer test) 阴性者为多杀性巴氏杆菌^〔9〕。

图 1

注: 1: 兔多杀性巴氏杆菌标准株C 51 － 17; 2: 禽多杀性巴氏杆菌 标准株C 48 － 1; M: DL 2000 marker; 3: 兔链球菌; 4: 兔支气 管败血波氏杆菌; 5: 兔大肠杆菌; 6: 兔葡萄球菌 图 1 PCR 反应特异性结果

以兔常见的4 种呼吸道病病原菌———兔链球菌、兔支气管败血性波氏杆菌、兔大肠杆菌和兔葡萄球菌的DNA 进行PCR 扩增，同时以禽和兔巴氏杆菌的DNA 作阳性对照，双蒸水作阴性对照。结果显示，除阳性对照外，其余扩增结果均为阴性。由此可见此PCR 反应对巴氏杆菌具有特异性。

按照1.5 反应体系及反应程序，在某项成分变化，其它成分不变的情况下，对引物浓度、 rTaq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、退火温度及模板浓度 (PCR 敏感性) 等反应条件进行优化，结果显示，引物浓度以加入量为5 pmol /μL 为最佳; rTaq DNA 聚合酶以0.1 U 为最合适量; dNTPs 的最佳加入量为0.2 mmol /L; PCR 退火温度以 50 ℃最合适; 最低模板浓度为1 pg。

图 2

注: 1-11: 100、500 fg、1、10、100 pg，1、10、100、 250、500 ng，1 μg; M: DL2000 marker。 图 2 PCR 敏感性检测

从图 2 可以看出，模板DNA 的量为1 pg 时仍能看到较清晰的条带，说明本试验建立的PCR 方法敏感性较好。

用本试验优化建立的PCR 方法对30 份临床疑似病料进行检测，24 h 内可出结果，检出阳性病例 27 份，检出率为90%; 用传统的实验室检测方法耗时3 ～ 5 d，鉴定出巴氏杆菌23 株，检出率为76.7%。表明PCR 方法检测速度快，灵敏度高。

本实验参照Genbank 中多杀性巴氏杆菌外膜蛋白 (OmpH) 的基因序列，在其高度保守区设计一对特异性引物，以期获得兔多杀性巴氏杆菌的序列。通过对兔链球菌、兔支气管败血性波氏杆菌、兔大肠杆菌和兔葡萄球菌以及阴性对照的扩增表明，本试验所建立的PCR 检测方法特异性高; 敏感性试验结果表明，将样品稀释至10-6时仍能扩出特异性条带，说明该PCR 方法检测兔多杀性巴氏杆菌具有很高的敏感性。

国内外有关兔多杀性巴氏杆菌临床病例方面的报道较多，而病原菌检测方法的报道却很少。由于该病传统的实验室检测方法(病原分离与生化鉴定等) 繁杂费时，且检出率较低; 黄艳艳^〔2〕和郭明章等^〔3〕建立的ELISA 检测法，也存在步骤繁多、敏感性较低等不足，因此，临床上常延误该病的及时确诊和有效治疗。本试验优化建立的PCR 检测方法，不需要进行病原菌的分离培养，只需从病料中提取DNA，利用特异性引物进行扩增，就可得到目的片段而做出诊断，具有特异性强、敏感性高、检测速度快等优点，24 h 之内就可检出结果，大大缩短了检测时间。用优化的PCR 方法对临床30 份疑似病料进行检测，并与传统的实验室检测方法进行比较。结果显示PCR 方法的阳性检出率为90%，传统方法的阳性检出率为 76.7%，说明PCR 方法较传统方法有更高的灵敏度，能对该病进行有效诊断。本试验建立的兔多杀性巴氏杆菌PCR 检测方法可为该病的临床快速诊断提供一定的技术支持。