志贺菌(Shigella，SHI) 、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA) 、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM) 、大肠杆菌O 157(Escherichia coli O 157，O 157) 是引起肠道疾病和危害食品安全的常见病原菌。目前对这些病原菌的检测主要依靠传统的国标方法进行细菌学培养，需要经过生化和血清学等多个步骤的检测，一般需3 ～ 5 d，操作繁琐，耗时费力，灵敏度低^〔1〕，因此，有必要建立快速有效的检测方法。多重PCR 方法可对多种细菌同步进行快速有效的检测，因此，多重PCR 方法检测多种细菌成为近年来细菌快速检测方法的研究热点^{〔2, 3, 4〕}。本研究建立同时检测志贺菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O 157 的多重 PCR 检测方法，对肠道疾病的控制及各类食品的检验提供了良好的检测手段，具有较高的实际应用价值。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及来源

副溶血性弧菌(ATCC 17802 标准株) 、 普通变形杆菌(ATCC 33420 标准株) 、腊样芽孢杆菌(ATCC 11778 标准株) (北京中原公司) 。金黄色葡萄球菌(分离株) 、单核细胞增生李斯特菌(ATCC 19111 标准株) 、沙门菌 (ATCC 13311 标准株) 、志贺菌(分离株) 、产气荚膜梭菌(分离株) 、空肠弯曲菌(ATCC 33291 标准株) 、大肠杆菌O 157 (分离株) (吉林出入境检验检疫局实验室) 。

1.1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒: EasyPureTM Genomic DNA Extraction KIT、PCR 试剂: 2 × Easy Taq PCR SuperMix、 Takara TaqTM Hot start version、100 bp DNA Ladder Marker(大连宝生物公司) ; 营养琼脂(nutrient agar，NA) 培养基、胰酪胨大豆琼脂培养基(tryptose soya agar，TSA) 血平板、溶菌肉汤 (luria-bertani，LB) 液体培养基，营养琼脂、革兰阴性(gram negative，GN) 增菌液均为(北京陆桥技术有限责任公司成品配制) 。

1.1.3 主要仪器

Binder 恒温培养箱(德国binder 公司) 、 Shellab 厌氧培养箱(美国Shellab 公司) 、Shellab 水浴箱(美国 Shellab 公司) 、Biometra PCR 仪(德国Biometra 公司) 、Alphalmager EC 紫外成像系统(美国Alpha 公司) 。

1.2 实验方法 1.2.1 菌种扩增

志贺菌和大肠杆菌O 157 用NA 培养基 37 ℃过夜培养，然后挑取3 ～ 4 个菌落接种到LB 液体培养基，在培养箱经过37 ℃培养24 h，提取DNA。金黄色葡萄球菌用TSA 血平板37 ℃过夜培养，取3 ～ 4 个菌落接种到LB 液体培养基，37 ℃培养24 h，提取DNA。单核细胞增生李斯特菌用TSA 血平板35 ℃培养24 h，取3 ～ 4 个菌落接种到LB 液体培养基，35 ℃培养24 h，提取DNA。

1.2.2 细菌DNA

提取细菌DNA 的提取按照EasyPureTMGenomic DNA Extraction KIT 试剂盒使用说明中的操作规程进行提取。

1.2.3 引物设计

按照引物设计原则，设计特异性引物。根据志贺菌ipaH 基因设计上游引物5'-ACCATGCTCGCAGAGAAACT-3'，下游引物5'-CTTCTGACCATAGCTTCGGC-3'; 根据李斯特菌hlyA 基因设计上游引物5'-CATCCATGGCACCACCAGC-3'、下游引物5'-TGGCGGCACATTTGTCACTGC-3'; 根据大肠杆菌O 157 hlyA 基因设计上游引物5'-CAGTAGGGAAGCGAACAGAG-3' 、下游引物5'-AAGCTCCGTGTGCCTGAAGC-3'; 根据金黄色葡萄球菌nuc 基因的序列设计上游引物5'-TAAAGCGATTGATGGTGATACG-3' 、下游引物5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTA-3'。 使用BLAST 程序，通过GenBank，对各引物及扩增产物同源性进行比对，以检测可能的重复序列，保证引物与靶基因结合的高度特异性。

1.2.4 单基因PCR 扩增

先对4 种菌进行单独扩增，反应体系: 模板DNA 2μL，上、下游引物各2 μL(10μmol /L) ，2 × Easy Taq PCR SuperMix 25μL，ddH₂O 19μL 总体积50μL。 PCR 扩增条件: 预变性95 ℃ 3 min，每个循环条件为95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34 循环，产物末端 72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物电泳检测，并对扩增产物进行核甘酸序列测定，与Genbank 中相应序列进行比较。

1.2.5 多重PCR 扩增及优化 1.2.5.1 设计正交试验

进行3 水平4 因素试验优化多重 PCR 反应体系，为了达到理想的多重PCR 扩增效果，根据 PCR 反应体系中Taq 酶(0.4、0.5、0.6 μL) 、三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP ) (6.0、8.0、 10.0μL) 、Mg²⁺ (0、0.1、0.2μL) 、引物(0.8、1.0、1.2μL) 4 个因素设计不同的3 种水平，从而得到9 种不同的多重PCR 反应体系组合，从中找出最佳多重PCR 反应体系。除了上述4 因素外，在总体50 μL 反应体系中，10 × Buffer 加5 μL，4 种细菌的模板DNA 各加3 μL，用ddH₂O 补足50 μL 反应体系。 多重PCR 扩增条件: 预变性95 ℃ 3 min，每个循环条件为 95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34 循环，产物末端72 ℃延伸10 min。

1.2.5.2 退火温度优化

采用温度梯度PCR 设定退火温度分别为58、59、60、61、62、63、64、65 ℃。引物浓度采用 1.2.5.1 中的最佳浓度，确定最佳退火温度。

1.2.6 多重PCR 特异性和敏感性检测 1.2.6.1 多重PCR 特异性检测

分别提取志贺菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、产气荚膜梭菌、普通变形杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌O 157 的基因组DNA，同时加入本次研究的4 种细菌对应的特异性引物进行多重PCR 扩增，以检测多重PCR 的特异性。

1.2.6.2 多重PCR 灵敏度检测

将4 种细菌37 ℃24 h 培养后，将其菌悬液10 倍递增稀释“10 ～ 10⁹”倍，按1.2.2 所述方法提取DNA，按照正交试验优化后的反应条件进行多重PCR 检测，同时对稀释的菌悬液分别取1 mL 倾注平板37 ℃培养进行菌落计数，多重PCR 能检出的最低细菌浓度为该体系的灵敏度。

1.2.7 人工模拟乳制品携带细菌的检测

购买市面上出售的牛奶，经高压灭菌后，将4 种菌的菌悬液任选3 种随机加入牛奶中，过夜培养。提取基因组DNA，进行多重PCR 检测。

2 结 果 2.1 单重PCR 扩增(图 1)

对选定的各自目的菌株，用编码志贺菌ipaH 基因的引物进行PCR，结果扩增出大小约为 113 bp 的特异性片段，用编码单核细胞增生李斯特菌hlyA 基因的引物进行PCR，扩增出大小约为155 bp 的特异性片段，用编码大肠杆菌O 157 的hlyA 基因的引物进行PCR，扩增出大小约为366 bp 的特异性片段，用编码金黄色葡萄球菌nuc 基因的引物进行PCR，扩增出大小约为283 bp 的特异性片段。通过核苷酸序列测定，与Genbank 中公布的基因序列同源性＞ 98%。

2.2 多重PCR 扩增优化结果 2.2.1 正交试验结果

通过正交试验设计得到本次多重 PCR 试验的最佳体系，即在50.0 μL 反应体系中，Taq 酶添加 0.6 μL，Mg²⁺添加0.2μL，4 种菌的上游引物各添加0.8 μL，下游引物各添加0.8 μL，dNTP 添加8.0 μL，10 × Buffer 添加5 μL，4 种菌的模板DNA 各添加3 μL，ddH₂O 添加17.8 μL。

2.2.2 多重PCR 退火温度的优化(图 2)

根据58、59、60、 61、62、63、64、65 ℃进行温度梯度PCR 后，结果显示第1 泳道电泳条带最亮，显示退火温度58℃为最佳。

2.3 多重PCR 特异性检测

加入10 种细菌DNA，同时加入本次研究的4 种细菌对应的特异性引物进行多重PCR 扩增，结果显示只有单增李斯特菌、志贺菌、大场杆菌O 157、金黄色葡萄球菌扩增出现特异条带，而其他6 种细菌均为阴性。

2.4 多重PCR 灵敏度检测(图 3)

对培养后的菌悬液10 倍递增稀释“10 ～ 10⁹”倍后进行多重PCR，结果第3 泳道稀释 107 倍时能够同时检测出4 种细菌。根据菌落计数结果，显示本研究中4 种细菌多重PCR 检测的灵敏度为1.8 × 10³ cfu /mL。

2.5 市售牛奶人工模拟染菌检测(图 4)

对市售牛奶经高压灭菌后人工随机染菌进行多重PCR 检测，结果显示多重 PCR 能够有效地扩增出相应的目的基因片段，从而识别出随机接种的任意3 种细菌。

3 讨 论

多重PCR 由于在单个反应体系中加入了不同的目的片段和特异性引物，所以需要对反应体系进行优化才能得到较好的扩增效果。正交试验设计就是对多重PCR 反应体系中各成分的比例进行优化设计的有效方法之一。Dabrowski^〔5〕、 郝玉芹^〔6〕、代娟^〔7〕等人通过正交实验设计对多重PCR 反应体系进行了优化，取得了良好效果。本研究在4 种病原菌多重 PCR 体系优化设计中采用了正交设计的方法，结果表明正交试验设计能够快速、有效地得到多重PCR 反应体系中各成分的最优组合，节省了人力和物力。

PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度，本研究中的多重PCR 方法由于加入了不同细菌目的基因的特异性引物，扩增出特异性目的片段，在实际应用中具有特异性强的特点。

本研究检测的灵敏度与沙丹等^〔8〕研究的多重PCR 灵敏度接近，高于Fujuoka^〔9〕和钱玉春等^〔10〕研究的多重PCR 的灵敏度，这可能与试验种细菌之间的相互抑制以及PCR 体系中各成分比例、循环参数等有关。

多重PCR 方法与传统细菌培养的方法比较具有特异性高、准确、快速、经济简便的优点，与普通PCR 方法比较具有通量较高的优点。多重PCR 方法的研究对及时判定病原菌、 有效控制病原菌传播、预防食物中毒的发生具有重要意义。