急性呼吸道感染性疾病对人类健康的威胁严重，严重者可在短时间内造成死亡。中国人口密度高，人员流动频繁，易于呼吸系统传染性疾病的传播。因此，及时检测呼吸道传染病的病原体、明确其致病性对公共卫生部门防控措施的制定至关重要。为了解2009 年辽宁省呼吸道传染病的病原体的感染现状，本研究采用辽宁省疾病预防控制中心建立的手工法高通量呼吸道标本检测技术对2009 年11-12 月收集的 362 例疑似重症甲型流感患者和236 例社区获得性肺炎患者标本进行了快速检测。结果报告如下。

(1) 标本采集: 2009 年11-12 月甲型流感流行期间，在辽宁省传染病监测平台覆盖的30 个哨点医院采集除新生儿(＜ 28 d) 外所有362 例疑似重症甲型流感患者^〔1〕和社区获得性肺炎患者^〔2〕的咽拭子、痰或呼吸道肺泡灌洗液等标本，4 ℃保存送辽宁省疾病预防控制中心实验室，－ 70 ℃低温冷藏保存。(2) 仪器与试剂: 12 道移液器(芬兰Biohit 公司) ; 配备96 孔板适配器的VX-200 漩涡震荡混合器(美国Labnet 公司) ; Allegra X-12R 离心机(美国Beckman 公司) ; RNA 提取试剂盒(德国Qiagen 公司) 。

采用手工法高通量呼吸道标本检测技术对收集的患者标本进行了快速检测。(1) 提取核酸: 将痰标本与等体积N －乙酰半胱氨酸溶液(10gNAC 溶于1L 生理盐水中) 混合，于室温震荡30 min，咽拭子和呼吸道肺泡灌洗液等标本可直接于漩涡混合器震荡3 次，每次30 s; 然后将裂解液置于一次性V 型槽中，用12 道移液器向96 孔深孔板中移入450 μL，分别加入待检测标本200 μL，96 孔板封板膜密封，置于漩涡震荡混合器上震荡1 min 后于室温3 000 r/min 离心1 min，在新的V 型槽中加入70%乙醇，揭去封板膜，重复上述步骤向每个样品孔中引入600 μL 70%乙醇并混匀后，将混合液用12 道移液器移入96 孔滤柱中，按RNA 提取试剂盒说明真空抽滤同时提取样品中的DNA 和RNA 于96 孔板中。(2) 呼吸道标本检测: 依据前期工作基础^〔3〕配制多重巢式－ 逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR) 检测体系置于V 型槽中，用12 道移液器将所需反应体积移入PCR 级200μL 96 孔PCR 反应板后，用12 道移液器将标本核酸移入反应板，封膜后1 000 r/ min 离心1 min，最后置于PCR 热循环仪中进行反应。

应用SPSS 15.0 软件进行一般描述性分析。

检测的362 例疑似重症甲型流感患者标本中，检出阳性标本236 例，阳性率为 65.2% ; 其中1 份标本检出2 种病原体的混合感染27 例，占阳性标本的11.4% 。检测的236 例社区获得性肺炎患者标本中，检出阳性标本145 例，阳性率为61.5% ; 其中1 份标本检出2 种病原体的混合感染29 例，占阳性标本的19.9% 。

表 1

表 1 疑似重症甲型流感患者病原体检测结果

表 1 疑似重症甲型流感患者病原体检测结果

362 例疑似重症甲型流感患者标本中共检测出11 种病原微生物，依次为甲型H1N1 流感病毒(H1N1) 34.2%(90/263) 、肺炎链球菌(Strep) 15.2% (40/263) 、偏肺病毒(hMPV) 11.4% (30/ 263) 、鼻病毒(Rhino) 10.6% (28/263) 、衣原体(Chla) 10.6% (28/263) 、支原体(Myco) 6.1% (14/263 ) 、流感嗜血杆菌 (HIB) 6.5% (17/263) 、副流感病毒(PIV) 1.9% (5/263) 、未分型甲型流感病毒(Flu A) 1.5% (4/263) 、冠状病毒(Cov) 1.1%(3/263) 和呼肠病毒(Reo) 0.8% (2/263) ，其中27 例混合感染在2 种病原体中各被计数1 次。

表 2

表 2 社区获得性肺炎患者病原体检测结果

表 2 社区获得性肺炎患者病原体检测结果

236 例社区获得性肺炎患者标本中共检测出10 种病原微生物，依次为肺炎链球菌(Strep) 31.0%(54/174) 、支原体(Myco) 20.7% (36/174) 、鼻病毒(Rhino) 16.7% (29/174) 、流感嗜血杆菌 (HIB) 10.3% (18/174) 、副流感病毒(PIV) 8.0% (14/174) 、 衣原体(Chla) 4.6% (8/174) 、未分型甲型流感病毒(Flu A) 8.1%(6/174) 、偏肺病毒(hMPV) 2.9% (5/174) 、呼肠病毒 (Reo) 1.1%(2/174) 和乙型流感病毒(Flu B) 0.6% (1/174) ，其中29 例混合感染在2 种病原体中各被计数1 次。

本研究结果表明，尽管疑似重症甲型流感患者和社区获得性肺炎患者疾病谱和暴露的病原微生物外环境基本相同，但同一时间段采集的社区获得性肺炎患者中甲型流感病毒的检出率明显低于疑似重症甲型流感患者。进一步分析发现，其不同病原体的构成比截然不同，在疑似重症甲型流感患者的病原体构成中甲型流感病毒占1/3 左右，肺炎链球菌接近 1/6，其他病毒类病原体为25.8%，其余近1/4 为其他细菌类病原体; 而在同时期社区获得性肺炎患者的病原构成中甲型流感病毒仅为4.0%，以肺炎链球菌为主的细菌性病原体达 66.6%。与曹彬等^〔5〕的研究结果一致，提示尽管甲型流感病毒感染后可能导致肺炎，但能力较弱，病情真正进展到肺炎阶段时很少有甲型流感病毒的检出。由此可见，辽宁省2009 年甲型流感病毒的流行尚难以导致SARS 那种危害严重的公共卫生事件，为避免影响正常社会秩序及经济发展，无需采取过多的公共卫生干预措施。