室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD) 是一种最常见的先天性心脏病(congenital heart disease，CHD) ，其发病率约为0.4%^{〔1, 2〕}。近年来，中国CHD 发生率呈上升趋势，已位居先天畸形第3 位，在新生儿非感染性死亡中占首位^{〔3, 4〕}，VSD 病因及致病机制研究对减少出生缺陷、提高出生人口素质具有重要意义。本研究从蛋白质组学角度出发，应用表面增强激光解析及电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption /ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS) 检测VSD 患者和健康对照人群血清蛋白表达谱并分析差异表达的标志蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳(ployacrylamide gel electrophoresis，PAGE) 分离标志蛋白，液相色谱串联质谱(liquid chromatograph /mass spectrometer，LC-MS) 进一步分离和鉴定，生信息学分析标志蛋白与VSD 关系。

30 例病例来自广西医科大学第一附属医院心血管内科，全部为经多普勒超声心动图或心导管造影确诊的单纯性VSD 患者，排除其他先天畸形，无发热、炎症，年龄2 ～ 17 岁; 30 例对照选自健康体检者，无先天畸形，无发热、炎症，按年龄、性别、民族、地区(市、县) 严格进行1: 1 匹配。所有研究对象均由家属签署知情同意书，在抽血前均接受问诊及体格检查。病例与对照收集时间为2009 年6-12 月。

生物蛋白芯片系统(PBS II C) 及其配套的CM10 芯片(美国Ciphergen 公司) 。4% ～ 12% NuPAGE Novex Bis-Tris 预制凝胶及系列电泳产品(美国Invitrogen 公司) 。LTQ Orbitrap 电场轨道阱回旋共振组合质谱仪(美国 Thermo 公司) 。

研究对象入院次日清晨采集空腹静脉血2 mL，冰盒取回后4 ℃冰箱静置2 ～ 3 h 待血液凝固。以3 000 r /min，4 ℃离心10 min，取上清液分装，置于－ 80 ℃冰箱保存。

参见文献〔5〕。

30 份VSD 病例及30 份健康对照血清等体积混合，分别构成病例与对照组混合血清。 乙腈沉淀法去除血清样品中高丰度白蛋白，浓缩至原始血清体积的1 /4，按血清19.5 μL、4 × NuPAGE样品缓冲液7.5 μL、10 × NuPAGE还原剂3.0 μL 混合，70 ℃ 水浴变性10 min，以12 000 r /min，离心5 min。取上清液上样(每孔大约 15 μL) ，以100 V 电压电泳2 h 40 min，0.25%考马斯亮蓝染色后脱色，扫描图像，应用凝胶定量软件Quantity One 分析分子量。比较电泳图谱，切取差异蛋白条带，胶内酶解。

以SELDI-TOF 结果中VSD 组与对照组相对表达比值最大的蛋白为目标蛋白，制备质谱样品。使用纳流量液相色谱(nano-flow LC) 系统进一步分离酶解后肽段，直接进入串联入LTQ-Orbitrap 质谱鉴定，质量扫描范围500 ～ 2000 Da，采集数据，用SEQUEST 算法进行 SWlSS-PROT56.9 蛋白质数据库检索。参数: 酶切方式为胰蛋白酶半酶切，碎片离子偏差容忍度为1 Da，母离子偏差容忍度为0.05‰，可变修饰为甲硫氨酸氧化，使用Trans-Proteomic Pipeline 蛋白检索软件鉴定蛋白，设置肽段的置信度95%，蛋白的置信度99%，且该蛋白至少包含＞ 2 个鉴定肽段。

鉴定得到的各蛋白在蛋白质数据库SWlSS-PROT/ TrAEM-BL 上进行搜索，把各完整蛋白的分子量、等电点和可能被剪切成的肽链与目的蛋白进行比较，选择可能与目的蛋白对应的完整蛋白或肽段进行基因和蛋白质水平的分析。

在分子量2000 ～ 20000 Da 范围共检测到蛋白质峰81 个，有统计学意义的(P ＜ 0.05) 差异蛋白峰有15 个，与对照组比较，VSD 组6 个蛋白表达上调、 9 个蛋白表达下调。这15 个蛋白质峰中有4 个相对表达比值＞ 2，其分子量分别为5419、5640、7779 和15054 Da，其中分子量为15054 Da 的蛋白在VSD 组与对照组的相对表达比值最大(数值为5) 。

图 1

注:箭头指示目的蛋白条带。 图 1 PAGE 凝胶电泳扫描图( 考马斯亮蓝染色)

VSD 组在15 kDa 左右与对照组存在明显差异蛋白条带，选择VSD 组该差异蛋白条带切胶进行后续的LTQ-Orbitrap 质谱鉴定。

谱鉴定出20 个蛋白质，其中鉴定到前纤维蛋白1(Profilin-1) 的唯一片段4 个，可信度为100%，覆盖率93%。

Profilin-1 含140 个氨基酸，分子量为15054 Da，与SELDI 检测到的目标蛋白分子量(15054 Da) 相同，质谱鉴定到的4 个唯一性片段 DSLLQDGEFSMDLR、DSPSVWAAVPGK、EGVHGGLINKK、TDKTLVLLMGK 与人Profilin-1 完全匹配，推测SELDI-TOF-MS 检测到的标志即为Profilin-1，Profilin-1 三维结构主要由3 个 α 螺旋和7 个β 折叠构成，含有肌动蛋白结合、磷脂酰肌醇结合、多聚L-脯氨酸结合3 个结构域。

VSD 作为一种多基因遗传病，机体生长发育、能量代谢、 细胞周期、细胞骨架等相关因子均参与其发生^〔6〕。而血清中包含着大量、可作为疾病标志物的蛋白质或多肽^{〔7, 8, 9〕}，本研究筛查VSD 人群和健康对照人群血清，共发现15 个差异表达蛋白质，提示这些蛋白质的上调或下调可能会促使VSD 的发生，某些可能是VSD 的血清标志蛋白。通过分离和鉴定及生物信息学分析，发现Profilin-1 即为筛查到的标志蛋白。

Profilin-1 表达及活性异常与多种心血管疾病发生、发展密切相关^〔10〕，并通过参与肌动蛋白的聚合－解聚动态平衡来调节肌动蛋白活性而发挥其生物学功能^{〔11, 12〕}，肌动蛋白通过调节转录从而调节心脏间隔的发育^〔13〕。研究发现^{〔14, 15〕}胚胎小鼠缺乏肌动蛋白基因或者肌动蛋白表达下调可导致心肌细胞结构紊乱和过度凋亡，心肌细胞增殖下降，致密层变薄，肌小梁紊乱，胎鼠出现室间隔缺损。Profilin-1 可以调节肌动蛋白活性，而肌动蛋白的异常表达可以导致心脏发育迟滞、室间隔结构异常，从而形成VSD 等先天性心血管畸形，Profilin-1 可能是VSD 的血清标志蛋白之一。