肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S． p ) 在世界范围内仍然是一种重要的病原体，可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎及菌血症等多种严重疾病^{〔1, 2〕}。为了及时准确地检测出疑似病例是否为肺炎链球菌感染，需要有灵敏特异的检测方法。虽然从样本中分离到肺炎链球菌被公认为是金标准，但实际在肺炎链球菌性肺炎的成人病例中，能够分离到菌株的只占20% ～ 30%，在儿童病例中＜ 10%。通常用于检测肺炎链球菌抗原和抗体的血清学方法，均缺乏一定的灵敏度和特异度^〔3〕。与培养方法相比，PCR 方法有很多优越性，敏感性高;能够扩增很多与链球菌相关的基因序列; 可以从死亡的微生物或污染的样本中检测出细菌DNA^{〔3, 4〕}。本研究采用PCR 扩增方法拟对自溶素基因(lytA) 和溶血素基因(ply) 进行检测，探讨对肺炎链球菌性感染病例检出的灵敏度和特异度。

株疑似肺炎链球菌分离自2004 年1 月－ 2007 年10 月在四川省成都市儿童医院治疗的呼吸系统感染患儿。31 001标准株，为前苏联国家检定所检定(中国药品生物制品检定所) 。血琼脂平板(津章生物科技开发公司) 。

Robocycler^®Gradient 40 型PCR 基因扩增仪(美国Stratagene 公司) ，UVIpro GAS 7001 X 凝胶影像分析系统(英国UVI 公司) ，DYY-2 C 电泳仪(北京市六一仪器厂) 。硅胶膜型TM基因组DNA 提取试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司) ，用于提取肺炎链球菌基因组DNA。蛋白酶 K、溶菌酶、Taq酶和10 × PCR buffer(日本TaKaRa公司) 。

开启肺炎链球菌保存管，吸取5 μL 保存液接种于血平板上，置于37 ℃、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。第2 d 挑取形态典型的单个肺炎链球菌菌落，转种于另一血平板进行大量培养，同时将31 001标准株也接种于血平板上，培养条件同上。第3 d 进行奥普托欣敏感性和胆汁溶解试验。首先刮取第2 d 转种的血平板上的菌苔均匀涂布于一新血平板下半部，将31 001标准株涂于同一血平板的上半部; 然后将直径6 mm 的5 μg 奥普托欣纸片分别放在血平板上、下两部的中间处，将血平板置于CO₂ 孵箱中，37 ℃培养 18 ～ 24 h。如果一个疑似菌株生长抑制区≥16 mm 时，即为肺炎链球菌; 生长抑制区＜ 16 mm，需要进行胆汁溶解试验来确认，若胆汁试验阳性可确定为肺炎链球菌。

根据已知肺炎链球菌国际通用标准株，即无致病性的野生R 6 株的lytA 和ply 基因序列设计引物，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。lytA 基因中273 bp 片段的引物序列，F: 5'-TGAAGCGGATTATCACTGGC-3'，R: 5'-GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG- 3'。25 μL PCR 反应体系中，各成分的终浓度分别为: DNA 模板20 ng /μL，dNTP 200 μmol /L，1 × PCR buffer，lytA 引物0.5 μmol /L，Taq 酶0.05 U/μL。反应条件为: 94 ℃预变性5 min; 随后进行30 个循环的扩增，94 ℃ 变性15 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s; 最后70 ℃终末延伸 10 min。

ply 基因中348 bp 片段的引物序列，F: 5'-ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA- 3'，R: 5'-GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC- 3'。25 μL PCR 反应体系中，各成分的终浓度分别为: DNA 模板20 ng /μL，dNTP 200 μmol /L，1 × PCR buffer，ply 引物0.5 μmol /L，Taq 酶0.05 U/μL。反应条件为: 94 ℃预变性5 min; 随后进行30 个循环的扩增，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s; 最后72 ℃终末延伸10 min。

对分离自成都市儿童医院的 161 株疑似肺炎链球菌经奥普托欣敏感性和胆汁溶解试验后，结果显示，共有146 株为肺炎链球菌，另15 株为草绿色链球菌。

图 1

注: 1 ～ 8: 流脑、流感嗜血、肺炎克雷伯、金葡、军团、大肠、阴性对 照、无乳链; 9: 肺链40900; 10: 肺链52035; 11: 肺链62353; 12: 100bp 梯度分子量标记。 图 1 对8 种细菌进行lytA 基因的PCR 扩增

对161 株菌全部进行lytA 基因的PCR 扩增，另对流行性脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、 肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、军团菌、大肠杆菌、无乳链球菌也同时扩增lytA 基因。

图 2

注: 1 ～ 8: 流脑、流感嗜血、肺炎克雷伯、金葡、军团、大肠、阴性对 照、无乳链; 9: 肺链40900; 10: 肺链52035; 11: 肺链62353; 12: 100bp 梯度分子量标记。 图 2 对8 种菌进行ply 基因的PCR 扩增

对161 株菌全部进行ply 基因的PCR 扩增，上述7 株菌也同时扩增ply 基因。

将15 株草绿色链球菌进行奥普托欣敏感性和胆汁溶解鉴定试验，结果显示，奥普托欣生长抑制区均＜ 16 mm，胆汁溶解试验均为阴性。15 株草链菌lytA 基因的扩增结果均为阴性，ply 基因的扩增中，仅有70 475、71 000 和41 387 菌株为阳性。

表 1

表 1 lytA、ply 在肺链、草链中的分布情况

表 1 lytA、ply 在肺链、草链中的分布情况

由146 株肺炎链球菌和 15 株草绿色链球菌的lytA、ply 基因的PCR 扩增结果显示，lytA基因的灵敏度为100% (146 /146) ，特异度为100% (15 / 15) ，阳性预测值为100% (146 /146) ，阴性预测值为100% (15 /15) 。ply 基因的灵敏度为100% (146 /146) ，特异度为 80%(12 /15) ，阳性预测值为98.0% (146 /149) ，阴性预测值为100%(12 /12) 。

众所周知，草绿色链球菌与肺炎链球菌在菌落形态上很相似，肉眼观察难以区分。因此，本研究将草链作为对照菌，探讨通过扩增lytA、ply 2 种基因的方法是否能将二者区分开。 本研究以161 株疑似肺炎链球菌的鉴定试验为金标准，由此得出，检测lytA 基因的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100%。有研究显示，通过扩增自溶素基因检测肺炎链球菌的灵敏度为92.8%，特异性为100%; 阳性和阴性预测值分别为100%和95%^〔5〕。Carvalho^〔6〕曾报道，在lytA、ply、 psaA(表面黏附素) 3 种基因中，lytA 基因的特异性最高，对来自于上呼吸道的样本特别是只能提取到微生物DNA 时，lytA 基因最适合于鉴定肺炎链球菌。扩增ply 基因时，15 株草链中有3 株是假阳性，表明，单独检测ply 基因，即使有的标本能扩增出该基因，实际上也可能不是肺炎链球菌感染。国外也有相同观点的报道，Messmer^〔7〕认为用ply 基因鉴定肺炎链球菌并非特异性，如果只检测ply 一种基因可能会导致假阳性的错误。本研究在其他7 种常见呼吸系统病原菌中，均未检测到lytA、ply 基因。杨永红等^〔8〕对20 株标准肺炎链球菌和7 株对照菌，通过扩增自溶素和溶血素基因后酶切的方法来检测肺炎链球菌，同样认为这2 套PCR 检测系统特异性强、灵敏度高。

本研究结果显示，检测lytA 基因的特异性高于ply 基因，表明lytA 基因比ply 基因更适用于检测肺炎链球菌。这一观点与Sourav^〔9〕的研究结果有相同之处。可是，由于某些临床分离株的自溶素基因发生变异，导致其对胆汁溶解试验不敏感^〔10〕，若只检测自溶素基因，此类菌株很可能被漏检。所以，在进行肺炎链球菌鉴定时，同时扩增自溶素基因和溶血素基因的2 套PCR 方案将更为可靠。