通过饮水自消化道摄入三价砷是地方性砷中毒发生的主要原因，阐明三价砷在胃肠道的生物转运机制是控制砷进入体内的关键。近年来体外研究结果表明，水－ 甘油通道蛋白 (aquaglyceroporins，AQGPs) 与砷的细胞转运有关。AQGP s (AQGP3、7、9、10) 属于水通道蛋白家族，除可转运水分子外，还可以转运甘油等中性小分子物质。研究发现与甘油有着类似空间构象、电荷分布且体积稍小的As(OH) 3 同样可通过 AQGPs 转运进入细胞^〔1〕，但目前研究多集中于低等真核生物细胞如酵母、非洲爪蟾卵母细胞和少数哺乳动物细胞系^{〔2, 3, 4, 5〕}。 本研究拟探讨三价砷在小鼠胃肠道的生物转运与AQGPs 及其表达的关系。

三氧化二砷(纯度99.96%) (德国Merck 公司) ; 硝酸镍(纯度99.999%) (美国Sigma 公司) ; 氯化汞(分析纯) (上海试剂一厂) ; 硝酸、双氧水(优级纯) (国药集团上海化学试剂有限公司) ; Trizol(上海生工生物工程技术有限公司) ; 反转录－ 聚合酶链式反应(RT-PCR) 两步法试剂盒(日本TaKaRa 公司) ; PCR 引物(上海英骏公司合成) 。 AA6800 石墨炉原子吸收仪(日本岛津公司) ; PTC-100 PCR 仪(美国MJR 公司) ; Gel DocTM XR 凝胶成像分析系统(美国 BIO-RAD 公司) 。

级雄性ICR 小鼠(南通大学实验动物中心) 56 只，许可证号SYXK(苏) 2009-0010，体重为18 ～ 22 g，普通饲料喂养。

将32 只小鼠随机分为4 组，每组8 只: 对照组(生理盐水) 、砷染毒组(As³⁺ 10 mg /kg) 、汞+砷组 (Hg²⁺ 10 + As³⁺ 10 mg /kg) 、甘油+ 砷组(体积比1: 1) ，经口灌胃给予相应受试物，联合染毒组两试剂给予时间间隔 10 min，灌胃量为0.1 mL/10 g。染毒2 h 后，处死小鼠取胃肠组织，用生理盐水冲洗3 次，0.2 g 中段组织用于砷浓度测定。

另外24 只小鼠随机分为对照组、砷染毒组、汞+砷组、甘油+ 砷组，每组6 只，受试物浓度同上，参照文献^〔6〕，以0.2 mL/min 的流速灌注由缓冲液配制的含不同受试物的37℃灌流液，灌流1 h 后取0.2 g 小肠中段组织测定砷浓度。

参照文献〔7〕，组织用浓硝酸和过氧化氢消化，采用石墨炉原子吸收法测定砷浓度，测定时加入基体改进剂2%硝酸镍溶液以提高灰化温度。石墨炉原子吸收仪升温程序: 150 ℃ 20 s; 250 ℃ 10 s; 600 ℃ 3 s; 1100 ℃ 10 s; 1100 ℃ 10 s; 2200 ℃ 2 s; 2500 ℃ 2 s; 检出限为 1 μg /L; 加标回收率为92% ～ 105%。

取对照组小鼠胃贲门、胃体、胃幽门部组织、十二指肠、空肠、回肠组织各100 mg，加入Trizol、氯仿、异丙醇提取RNA。按RT-PCR 两步法试剂盒说明进行基因表达水平半定量检测。 PCR 引物序列如下: AQP3 上游5'-GTGGCTTCCTCACCATCAAC- 3'，下游5'-CATGTCCAAGTGTCCAGAGG-3'; AQP7 上游 5'-GCTATCTCGGTGTCAACTTG-3'，下游5'-CTGGACTGTTCTTCTTGTCG- 3'; AQP9 上游5'-GAAGGATGGAGTGGTTCAAG- 3'，下游5'-CAGAAGGAGGAACATGGTAG-3'; β-actin 上游5'- CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'，下游5'-CTCCGGAGTCCATCACAATG- 3'。cDNA 合成: 65 ℃ 5 min，逆转录42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min; PCR 扩增: 94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s，57℃退火30 s(AQP7 /9 退火温度为55 ℃) ，72 ℃延伸1 min，28 个循环(循环数AQP9 为30 个，β-actin 为22 个) ; 72 ℃终末延伸10 min。取5 μL PCR 扩增产物于1.5% 琼脂糖凝胶中，100 V 电泳30 min。实验重复3 次，凝胶成像系统分析各条带平均灰度值，以β-actin 为内参照对各基因表达水平进行半定量。

用SPSS11.0 统计软件进行数据录入和处理，组间比较采用非配对t 检验，以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

表 1

表 1 不同组别小鼠胃肠组织中砷浓度(x±s，μg /g，n = 8)

表 1 不同组别小鼠胃肠组织中砷浓度(x±s，μg /g，n = 8)

小鼠灌胃给予 As³⁺后，胃和小肠组织中砷浓度比对照组明显升高，胃组织中砷浓度明显高于小肠组织(t = 37.56，P ＜ 0.01) 。给予Hg²⁺ 或甘油后再给予As³⁺，胃肠组织中砷浓度比单独染砷时明显下降(t = 4.87 ～ 9.92，P ＜ 0.01) 。Hg²⁺ + As³⁺ 组和甘油+ As³⁺组胃肠组织中砷浓度差异无统计学意义。

对照组、染砷组、汞 +砷和甘油+砷组小肠组织中砷浓度分别为(0.07 ± 0.01) 、 (13.94 ± 0.78) 、(10.37 ± 0.29) 、(10.21 ± 0.44) μg /g，加入 Hg2 +或甘油后小肠组织中砷浓度比单独染砷组明显降低 (t = 10.47、10.20，P ＜ 0.01) 。

图 1

注: 1: 胃贲门; 2: 胃体; 3: 胃幽门; 4: 十二指肠; 5: 空肠; 6: 回肠。 图 1 对照组小鼠胃肠组织中AQP 3、7、9 mRNA 表达

胃肠组织均表达AQP3，胃组织AQP3 的表达水平明显高于空肠和回肠; 胃体部AQP3 表达水平与空肠比较，差异有统计学意义(t = 3.46，P ＜ 0.05) ; 十二指肠AQP3 的表达水平明显高于小肠其他各段(t = 3.35、6.11，P ＜ 0.01) 。此外，小肠组织还表达AQP7，胃组织表达AQP9。

据报道，目前中国慢性砷中毒确诊患者约3 万人，处于高砷暴露的人口达3000 万^〔8〕。已知砷在胃肠道的吸收率较高，可达95% ～ 97%以上，探明砷进入胃肠道的生物转运途径对于地方性砷中毒的预防具有重要意义。本研究用三价砷对小鼠进行灌胃染毒及原位小肠灌流，发现给予Hg²⁺ 或甘油的小鼠胃肠组织中砷浓度比单独染砷时明显下降。Hg²⁺ 和甘油均是水－甘油通道蛋白的抑制剂，二价汞离子可与该蛋白最狭窄部位的半胱氨酸残基(C189) 结合从而抑制其转运功能，甘油则可与其他物质竞争水－ 甘油通道^〔9〕。给予AQGPs 抑制剂后能抑制小鼠胃肠组织吸收砷，提示AQGPs 与砷在胃肠道的生物转运有关。

RT-PCR 结果显示AQGPs 在胃肠道广泛高表达，这可解释砷在胃肠道的高吸收率。胃体部AQP3 表达水平与空肠比较，差异有统计学意义，胃中段组织中砷浓度也明显高于小肠中段组织，提示组织中砷浓度的高低与组织AQP3 表达量有关。但是目前有关AQP3 在砷转运进入细胞中的作用尚存在争议，Liu 等^〔10〕认为AQP 7、9 在非洲爪蟾卵母细胞中是更为有效的砷转运蛋白，而AQP3、10 几乎无转运作用; 但Lee 等^〔11〕通过RNA 干扰实验却证实AQP3 与肺腺癌细胞CL3 摄取砷及细胞对砷的敏感性有关，本研究的结果支持AQP3 可能是砷的转运蛋白，但还需进一步研究证实。