中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (4): 410-411   PDF    
引用本文
李梓民, 邹云飞, 邹学敏, 袁萍, 贺栋梁, 胡余明. 茶多酚对甲醛致人脐静脉内皮细胞损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(4): 410-411.
LI Zi-min, ZOU Yun-fei, ZOU Xue-min,et al. Effect of tea polyphenols on formaldehyde-induced damage of human umbilical vein endothelial cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(4): 410-411.
茶多酚对甲醛致人脐静脉内皮细胞损伤保护作用
李梓民1, 邹云飞2, 邹学敏3, 袁萍4, 贺栋梁3, 胡余明1     
1. 湖南省疾病预防控制中心毒理检验科, 长沙410005;
2. 皖南医学院;
3. 南华大学;
4. 长沙医学院衡阳校区
收稿日期: 2010-04-28.
基金项目: 湖南省教育厅科研基金(09C142)
作者简介: 李梓民(1979- ),男,湖南衡阳人,医师,硕士,主要从事食品营养毒理研究工作。
通讯作者: 胡余明,E-mail:huyuming@uipsina.com
摘要: 目的 观察茶多酚对甲醛致人脐静脉内皮细胞氧化损伤的影响。方法 体外常规培养内皮细胞,实验设正常对照组、甲醛损伤组(0.1 mmol/L)、茶多酚组(2.5、5、10、20 mg/L)。其中茶多酚先与细胞预孵12 h后加入甲醛,置CO2培养箱培养4 h,检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)活力及乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮和细胞中谷胱甘肽含量,免疫细胞化学法检测核转录因子(NF-κB)。结果 2.5、5、10、20 mg/L茶多酚组LDH、MDA含量分别为2 021.02、1 878.17、1 748.56、1 625.72 U/L和3.50、3.30、2.99、2.68 nmol/mL,均分别低于甲醛损伤组,差异有统计学意义(P<0.01);SOD与GSH活力分别为24.16、24.67、25.56、26.02 U/mL和0.334、0.364、0.445、0.449μmol/mg prot均高于甲醛损伤组(P<0.01);茶多酚各组NF-κB活力与甲醛组比较明显下降(P<0.01)。结论 茶多酚可提高内皮细胞抗氧化酶活性,减轻甲醛所致氧化损伤。
关键词: 茶多酚     甲醛     人脐静脉内皮细胞     氧化损伤     核转录因子NF-κB    
Effect of tea polyphenols on formaldehyde-induced damage of human umbilical vein endothelial cells
LI Zi-min, ZOU Yun-fei, ZOU Xue-min,et al    
Department of Toxicologic Detection, Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Changsha 410005, China
Abstract: Objective To observe the effect of tea polyphenols(TP)on formaldehyde-induced oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells.Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured with Dulbeccos modified Eagles medium in vitro and selected for exponential phase of growth for the experiment.Three groups were established as nomal group,formaldehyde injured group(0.1 mmol/L),and TP protection groups(2.5,5,10,and 20 mg/L),in which the tea polyphenols was firstly preincubated with the cells for 12hr before adding formaldehyde,followed by culturing for 4hr in CO2 incubator.The activity of superoxide dismutase(SOD)in cell culture solution,the level of lactate dehydrogenase(LDH),malondialdehyde(MDA),nitric oxide(NO)in the culture,and glutathione(GSH)and the activity of nuclear factor-kappa B(NF-κB)in the cells were detected.Results There were statistical differences in the levels of LDH, MDA,and NO between TP protection groups and formaldehyde-injured group,with the LDH levels of 2 021.02,1 878.17,1 748.56,and 1 625.72 U/L,MDA of 3.50,3.30,2.99,and 2.68 nmol/mL,and NO of 79.09,75.07,66.79,and 60.59 μmol/L for the TP group of 2.5,5,10,and 20 mg/L,respectively.Although the activity of NF-κB was significantly lower than that of formaldehyde group,the activity of SOD,GSH of the TP protection group were different from that of formaldehyde-injured group(P<0.01),with the SOD activity of 24.16,24.67,25.56,and 26.02 U/mL,GSH of 0.334,0.364,0.445,and 0.449μmol/mg,all higher than those of formaldehyde-injured group(SOD=23.72 U/ml and GSH=0.325 μmol/mg).Conclusion Tea polyphenols can increase the activity of antioxidant enzymes in endothelial cells and reduce oxidative damage caused by formaldehyde.Tea polyphenols can lower generation of NO and ease intracellular lipid peroxidation by inhibiting the expression of NF-κB.
Key words: tea polyphenol     formaldehyde     human umbilical vein endothelial cell     oxidative damage     nuclear factorkappa B(NF-κB)    

大量动物实验研究表明，甲醛可致内皮细胞及多组织器官氧化损伤〔1, 2〕。从山茶科植物茶树的干燥嫩叶或叶芽制成的绿茶中提取的茶多酚(tea polyphenols，TP) ，是茶叶中主要生物活性物质。近年来，研究发现，茶多酚具有抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、强心、抗衰老和抗菌等作用，并且揭示这些生物活性均与其抗氧化作用有关〔3〕。因此，本实验探讨茶多酚对甲醛致人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12) 损伤抗氧化系统的影响，为临床防治甲醛致心血管毒性提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 细胞株

人脐静脉内皮细胞HUVEC-12 (编号CRL- 2480) (美国菌种保藏中心) 。属于正常人脐静脉内皮细胞，内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原阳性，具有贴壁生长、接触抑制、 密度依赖性等生物学特征。

1.2 主要仪器及试剂

5400 型CO2 培养箱(法国NAPCO 公司) ; CK40-F200 型倒置相差显微镜(日本Olympus 公司) ; TGL-16H 高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司) ; AB204-N 电子分析天平(上海梅特勒－ 托利多仪器有限公司) ; UNICO WFJ2100 型可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司) 。分析纯; 茶多酚(无锡太阳绿宝科技有限公司) ; 丙二醛 (MDA) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽(GSH) 、一氧化氮 (NO) 、乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所) ; 核转录因子(NF-κB) p65(美国Santa Cruz 公司) 。

1.3 实验分组

体外常规培养内皮细胞，取对数生长期细胞进行实验。设6 组: 正常对照组、甲醛损伤组(0.1 mmol/L) 及 4 个茶多酚组(2.5、5、10、20 mg/L) 。其中茶多酚先与细胞预孵12 h 后加入甲醛，置CO2 培养箱培养4 h 后，检测相关指标。

1.4 检测指标与方法 1.4.1 细胞培养

将处于对数生长期的HUVEC-12 细胞，以 1 × 105/mL 浓度，接种于含10% 小牛血清的改良Eagle 培养基(DMEM) 中，37 ℃，5% CO2，饱和湿度环境下培养。倒置相差显微镜下观察，细胞呈多角形，单层铺路石状排列。DHank液洗2 遍，0.25%胰酶消化5 min，吹打均匀，1:3 传代培养。

1.4.2 LDH、MDA、SOD 活性和NF-κB 测定

将细胞接种至 24 孔培养板，每孔1mL，细胞密度1 × 105/mL，培养至80%融合，弃去培养液，D-Hank液清洗2 遍，1%小牛血清的DMEM 培养液同步化24 h，分组处理，终止培养后，取细胞上清液 100 μL，按测试盒说明分别进行LDH、MDA、NO 含量和SOD 活性测定。每组设3 个复孔，同一实验重复3 次。将细胞接种至预先放有盖玻片的6 孔板中，每孔2 mL，按上述培养方法，采用免疫细胞化学法检测NF-κB。

1.4.3 细胞内GSH 含量测定

采用还原法〔4〕，取制备200 μL 裂解液按试剂盒说明测定GSH 含量，另取1 mL 裂解液采用双缩脲法测蛋白含量。每组设3 个复孔，同一实验重复 3 次。

1.5 统计分析

采用SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析，以P ＜ 0.05 判定差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 茶多酚对LDH、NO 含量及NF-κB 表达影响(表 1)
表 1 茶多酚对LDH、NO 含量及NF-κB 表达影响(x±s，n = 9 )

甲醛可以导致细胞LDH 漏出量和NO 释放量明显增加、细胞 NF-κB 表达增强，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜ 0.01) ;预孵茶多酚12 h 的内皮细胞加入0.1 mmol/L 甲醛，LDH漏出量和NO 释放量逐渐减少、NF-κB 的表达逐渐减弱，并随茶多酚浓度增加其含量和表达呈下降趋势(P ＜ 0.01) 。

2.2 茶多酚对SOD、MDA、GSH 含量影响(表 2)
表 2 茶多酚对GSH 、SOD、MDA 的影响(x±s，n = 9)

甲醛导致细胞内GSH 含量减少，SOD 活性下降，其过氧化产物MDA 的释放量明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜ 0.01) ; 预孵茶多酚12h 后，细胞内GSH 含量、SOD 活性均有不同程度的增加，MDA 的释放量均随茶多酚浓度的增加明显减少与甲醛组比较差异均有统计学意义(P ＜ 0.01) 。

3 讨 论

大剂量或长期低剂量甲醛负荷，导致机体抗氧化系统的清除能力降低，其中以心血管内皮细胞的氧化损伤尤为严重〔4, 5〕。甲醛具有抑制内皮细胞超氧化物歧化酶活性，与 GSH 结合成硫代半缩醛而导致GSH 耗竭，使自由基不能及时清除，间接产生对组织细胞的氧化损伤〔5〕，从而使机体的抗氧化能力明显降低。

本实验发现，一定剂量茶多酚可使细胞内GSH 含量、 SOD 活性均有不同程度增加，而LDH 漏出量、MDA 释放量均随茶多酚浓度增加明显减少，提示一定剂量茶多酚能提高抗氧化酶活力，减轻脂质过氧化作用，拮抗甲醛对内皮细胞氧化损伤。茶多酚作为一种多酚羟基化合物，具有直接清除活性氧，抑制脂质过氧化损伤，激活细胞内抗氧化防御体系的作用，还具有鳌合金属离子作用，这种抗氧化作用与茶多酚清除氧自由基，增强SOD 等抗氧化酶活力有关〔6, 7〕。本研究结果还显示，茶多酚可使NO 释放量逐渐减少，且呈剂量－效应关系。同时，茶多酚各组NF-κB 的表达逐渐减弱，且随茶多酚浓度的加大NF-κB 的表达减弱明显。表明茶多酚可能通过抑制NF-κB 表达，减少NO 产生，减轻细胞内脂质过氧化而保护内皮细胞功能。

参考文献
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