手足口病是由多种肠道病毒引起的常见传染病,以婴幼儿发病为主。大部分患者症状轻微,以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹、呼吸道感染、心肌炎,个别重症患儿可发生死亡^〔1〕。重症病例主要是肠道病毒71型(EV71)感染,也有报道感染柯萨奇病毒A组16型等引起的死亡。近年来,EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势,其中最令人关注的是EV71可引起患儿的神经症状甚至死亡。贵州省2009年感染EV71的重症患儿比2008年明显增多,疫情也比2008年开始的早。为了探讨EV 71是否发生了抗原漂移,分析引起重症的EV71毒株是否与核苷酸序列有相关性,本研究对2008-2009年手足口病患者标本进行了病原诊断,并对部分EV 71感染的重症患者进行基因测序及特征分析,结果报告如下。

对贵州省2009年1-12月法定传染病网络直报系统的手足口病疫情资料按地区、时间、年龄、性别与职业分布进行统计,根据报告医院卡片数计算部分医院报告比例。

(1)标本采集与检测:参照文献〔2〕,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对临床诊断后采集的550份手足口病标本进行肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇A组16型(CA 16)及常见引起手足口病的肠道其他病毒检测。(2)重症病例密切接触者检测:采集7例确诊EV 71感染重症病例的密切接触者标本共13人份及幼儿园发病儿童的密切接触者28人份,共计41人份,进行RT-PCR病原诊断。(3)分析比较:采用描述流行病学方法对轻型病例、重症病例、死亡病例及总病例、临床诊断与实验室诊断病例的比例及实验室诊断病原感染者构成比例、采样率及阳性率进行分析比较。(4)EV71型病毒株VP 1区域序列测定及分析:对2008年分离株3株及2009年死亡病例、重症病例分离株7株EV71病毒的VP1区进行扩增产物测序,测序由北京诺赛基因组研究中心完成,选取G enBank中EV 71各基因型(A、 B1、 B2、 B4、C1、 C2、C3、 C4)及亚型的代表毒株以及国内近期发表的部分毒株序列,与本研究中的10株EV 71 227 bp进行系统进化分析。

序列分析和系统进化分析软件包括Bi-oEdit、 ClustalX(1.83)和MEGA 4。

贵州省2009年手足口病发病率比2008年增加91.04 %,年发病率为33.042 7/10万,年死亡率为0.052 8/10万。全省9个市(州、地)均有报告,其中5个市(州、地)报告有死亡病例;4-9月为发病高峰,占全年发病数的82.99 %,其中4月份发病占全年报告发病数的16.14%,5月份占18.67%,6月份占15.67%,7月份占15.54 %,8月份占10.03 %,其余各月比例均< 10%。高发年龄为0~ 5岁组,占91.18%,其中0~ 3岁为主,占73.66%;发病者男:女性别比例为1:1.77;散居儿童发病最多,占66.64%,其次为托幼儿童,占26.81%,学生占6.01%,其他成年人病例占0.54%;重症死亡病例均为0~3岁散居婴幼儿。

全年采集手足口病患者样品550份,采样率为4.39%;其中EV 71阳性149份,阳性率为27.09%;CA 16阳性8份,阳性率为1.45%;其他肠道病毒阳性17份,阳性率为3.09%。2009年手足口病重症病例为232例,其中临床诊断手足口病死亡患儿22例,咽拭子及肛拭子标本检出EV 71感染17例,其他肠道病毒阳性3例,阴性2例。重症病例及幼儿园发病儿童密切接触者标本中,EV 71阳性30例,阳性率为73.17 %,其中幼儿园2例合并CA 16感染,合并感染阳性率为4.9 %;其余为阴性。

2008年分离株3株及2009年死亡病例、重症病例分离株7株EV 71病毒,经B ioEd it、 C lustalX(1.83)软件拼接比对,结果显示,10株病毒V P1区基因核苷酸序列的同源性为96% ~ 100%,与2008年安徽阜阳、合肥、广东珠海、山东、浙江等地的EV 71毒株的氨基酸同源性较高,其中2008年分离株有2株与安徽阜阳、山东株同源性为100%。

10株EV 71病毒贵州分离株与中国大陆分离毒株、中国台湾以及韩国、日本等近年部分分离株均属于C4基因亚型。在系统进化树上,10株贵州分离株按标本采集地区及年份聚集成小的分枝,同时与2008年安徽阜阳、山东分离株,2005年浙江等其他省份分离株进化距离较近并聚集成分枝。

贵州省2008年手足口病无死亡病例报告,2009年手足口病重症病例及死亡病例明显高于2008年,发病率上升近2倍。其中重症病例及幼儿园病例密切接触者携带EV 71的检出率较高,表明感染人群扩大。重症病例及死亡病例中散居儿童多于托幼儿童,散居儿童多为流动人口,发病不能及时得到正确诊断和治疗是死亡的主要原因。实验室诊断结果表明,2009年贵州省手足口病以EV 71为主,存在少数合并CA 16感染病例。发病与其他肠道病原(如:柯萨奇A组4、 5、7、 9、 10型,柯萨奇B组2、 5、 13型等)传播也有密切关系,部分病原也引起幼儿死亡,但这些病原有待于下一步进行鉴定^〔3〕。

相关文献报道表明^{〔4, 5〕},中国北京、上海、广州、深圳等地的手足口病EV 71分离株的基因亚型与台湾分离株有很高同源性,提示上述地区的手足口病流行可能是当年台湾流行时传入的病原。本研究中2008-2009年的10株病毒V P1区基因核苷酸序列的同源性为96% ~ 100 %,基因亚型未发生改变,但感染同一基因型病毒,致病结局可能不同^〔6〕。目前有关EV 71毒株全基因序列资料较少,所以尚不清楚致病力、神经毒力与EV 71基因型的关系。

上述结果表明,EV 71病毒的C4亚型在我国有着较为广泛的传播,贵州省分离株中尚未发现C4以外的亚型流行,同一地域的毒株进化距离也较近。提示可以通过对贵州省EV71毒株亚型的监测,观察C4亚型的分布、传播及变异特点,为预防控制手足口病流行提供分子生物学上的参考依据。