中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (3): 335-336   PDF    
引用本文
江蓓, 高海青, 李保应, 翟茜, 李宪花, 程梅. 白藜芦醇对高糖诱导系膜细胞增殖抑制作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(3): 335-336.
JIANG Bei, GAO Hai-qing, LI Bao-ying, et al. Inhibitory effect of resveratrol on high glucose-induced proliferation of mesangial cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(3): 335-336.
白藜芦醇对高糖诱导系膜细胞增殖抑制作用
江蓓, 高海青 , 李保应, 翟茜, 李宪花, 程梅    
山东大学齐鲁医院泌尿内科 山东 济南 250012
收稿日期: 2010-09-21.
作者简介: 江蓓(1970- ),女,山东即墨人,副主任医师,博士,主要从事肾小球疾病的研究。
通讯作者: 高海青,E-mail:gaohaiqing52@yahoo.com.cn
摘要: 目的 研究白藜芦醇对高糖条件下系膜细胞增殖的影响,为白藜芦醇治疗糖尿病肾病提供实验依据。方法 体外培养大鼠系膜细胞,分为5组:对照组、高糖组、白藜芦醇2.5、5、10μmmol/L组;应用细胞计数Kit8(CCK8)法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果 高糖组细胞增殖率为(105.74±1.78)%,较对照组增高(P<0.01);白藜芦醇组细胞增殖率分别为(101.38±3.62)%、(96.55±1.28)%、(91.95±2.40)%,较高糖组减低(P<0.05或P<0.01);高糖组G1期细胞比例(62.86±1.57)%较对照组(57.93±2.70)%增高(P<0.05),白藜芦醇组G1期细胞比例较高糖组减少,其中10μmmol/L组与高糖组比较差异有统计学意义(P<0.05);高糖组S期细胞比例(29.00±1.08)%较对照组(34.91±1.43)%减少(P<0.01),白藜芦醇组S期细胞比例较高糖组增高,其中5、10μmmol/L组与高糖组比较差异有统计学意义(P<0.01);白藜芦醇5、10μmmol/L组细胞凋亡率分别为(2.20±0.53)%、(4.53±0.31)%,明显高于高糖组(P<0.01)。结论 白藜芦醇能抑制高糖诱导的系膜细胞增殖;白藜芦醇抑制增殖与影响细胞周期及诱导凋亡有关。
关键词: 白藜芦醇     系膜细胞     细胞周期     凋亡    
Inhibitory effect of resveratrol on high glucose-induced proliferation of mesangial cells
JIANG Bei, GAO Hai-qing , LI Bao-ying, et al    
Division of Nephrology, Qilu Hospital, Shandong University, Ji'nan 250012, China
Abstract: Objective To evaluate the effect of resveratrol on glucose-induced proliferation of mesangial cells.Methods The cultured mesangial cells were divided into five groups: control, high glucose, 2.5(2.5μmmol/L resveratrol plus 25 mmol/L glucose), 5(5μmmol/L resveratrol plus 25 mmol/L glucose), and 10 μmmol/L group(10 μmmol/L resveratrol plus 25 mmol/L glucose).The effect of resveratrol on mesangial cell proliferation was assessed with cell counting kit-8 (CCK 8).The percent of cell cycle and apoptosis were examined with flow-cytometry.Results The viability in high glucose group was 105.74±1.78% and significantly higher compared to that of the control group(P<0.01).After treat ment with resveratrol, the viability were 101.38±3.62%, 96.55±1.28%, and 91.95±2.40%, which were lower compared to high glucose group(P<0.05, P<0.001).The percent of G1 in high glucose group increased compared to that of the control group(62.86%±1.57% vs 57.93%±2.70%, P<0.05).After treatment with resveratrol, the percent of G1 in 10 μmmol/L group decreased compared to that of the high glucose group (57.66%±2.49% vs 62.86%±1.57%, P<0.05).The percent of S in high group reduced compared to that of the control group(29.00%±1.08% vs 34.91%±1.43%, P<0.01).After treamtent with resveratrol, the percent of S in 5 and 10 μmmol/L groups were increased compared to that of the high glucose group(P<0.01).The percent of apoptosis in 5 and 10bμmmol/L groups were 2.20%±0.53% and 4.53±0.31%, and higher than that of the high glucose group(P<0.01).Conclusion High glucose-induced proliferation of mesangial cells is inhibited by resveratrol therapy.The mechanisms of the inhibition include mesangial cell S phase arrest and cell apotopsis.
Key words: resveratrol     mesangialcell     cell cycle     apoptosis    

糖尿病肾病(diabetic nephro pathy,DN)是糖尿病患者最主要的微血管病变,是糖尿病患者死亡的重要原因〔1〕。目前DN已经上升为欧美国家终末期肾脏病的首位病因,在中国DN发病率也呈上升趋势,探索DN的诊治方法一直是国内外研究的热点。白藜芦醇(resveratrol)属非黄酮类的多酚化合物,广泛存在于虎杖、葡萄、花生等70余种植物中〔2〕,具有抗癌、抗氧化、抗炎等多种作用。白藜芦醇的抗肿瘤、心血管保护作用一直备受关注,近年来研究发现白藜芦醇具有改善胰岛素敏感性及降低血糖的作用〔3〕,因而用于糖尿病治疗的研究逐渐增多,但治疗DN的相关研究较少〔4, 5〕,作用机制尚未完全清楚。本实验通过探讨白藜芦醇对高糖刺激下系膜细胞增殖的影响,为白藜芦醇用于治疗DN提供实验依据。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

BB5060UV二氧化碳细胞培养箱(德国Heraeus公司)、倒置光微镜、光学显微镜(日本Olympus公司)、BeckmanL8-55M超高速离心机(美国Beckman公司)、LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)、BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。小牛血清(美国Front公司)、胰蛋白、d-葡萄糖(美国Sigma公司)、RPMI 1640培养基干粉(美国Gibco公司)、白藜芦醇(天津尖峰天然产物研究开发有限公司,纯度> 98%,批号0810018-22)、Annexin/PI双染试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)、细胞计数Kit8(CCK8)试剂盒(日本同仁化学研究所)。

1.2 方法 1.2.1 CCK8法测定白藜芦醇对系膜细胞增殖影响

大鼠系膜细胞(RM C)株(山东省医学科学院基础医学研究所)第5~7代细胞用于实验。加0􀀁25%胰酶消化,调整细胞浓度为5×107个/L,加入96孔板中,每孔100 μL,37 ℃、5% CO2孵育箱中孵育过夜。白藜芦醇稀释至100 μmmol/L,然后倍比稀释5个稀释度分别加入96孔板,每孔100 μL,另设空白对照和1640对照,每组设3个复孔,培养48 h后加入CCK8试剂20μL继续培养2h,酶标仪测定450 nm处吸光度(A),绘制RMC增殖曲线。计算公式:增殖率(%)=(检测孔A值/空白对照孔A值)×100%

1.2.2 实验分组

根据白藜芦醇对RMC增殖影响的浓度曲线,在RMC增殖率> 90%的浓度范围内,选取2.5、5、10 μmmol/L 3个白藜芦醇作用浓度,将细胞分为5组:对照组,高糖组(葡萄糖终浓度为25 mmol/L),白藜芦醇2.5、5、10 μmmol/L组(高糖+终浓度分别为2.5、5、10 μmmol/L白藜芦醇)。

1.2.3 RMC增殖率的测定

按上述分组取细胞100 μL加入96孔板中孵育过夜,白藜芦醇稀释至相应浓度加入相应孔中,培养1 h后加入相应浓度的葡萄糖溶液,继续培养48 h加入CCK8试剂,按试剂盒步骤操作,并计算RMC增殖率。

1.2.4 RMC细胞周期测定

取细胞100 μL,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,加500 μL碘化丙啶(PI)工作液混匀,置于冰上避光染色15 m in,流式细胞仪检测细胞周期并用软件分析结果。

1.2.5 RMC凋亡率测定

取细胞100 μL,加5μL Annexin V-FITC工作液和5μL PI工作液,再加入480μL PBS混匀,置于冰上避光染色10 min,流式细胞仪检测细胞Annex in V(+)/PI (+)百分率。

1.3 统计分析

实验所得计量资料均以 x±s表示,采用SPSS 10.0软件进行统计分析,多组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 RMC的形态学变化

对照组和高糖组细胞呈梭形,细胞贴壁生长,增殖良好。白藜芦醇组随浓度增加细胞增殖受抑制,表现为细胞数量减少,细胞伪足收缩,数量减少,贴壁细胞减少,有较多细胞呈圆形。

2.2 RMC增殖率及凋亡率(表 1)
表 1 RMC 增殖率及凋亡率

以对照组增殖率为100%,则高糖组增殖率为(105.74±1.78)%,较对照组增殖率增高(P < 0.01)。白藜芦醇处理后3组增殖率均较高糖组明显减低(P < 0.05或P < 0.001)。白藜芦醇处理后凋亡率逐渐增高,其中5、10 μmmol/L组凋亡率较高糖组明显增加(P < 0.01)。

2.3 RMC的细胞周期分布(表 2)
表 2 RMC细胞周期分布

高糖组G1期细胞比例较对照组增高(P < 0.05),S期细胞比例较对照组减少(P < 0.01)。白藜芦醇处理后,G1期细胞比例逐渐减少,其中10 μmmol/L组较高糖组明显减少(P < 0.05)。S期细胞比例逐渐增加,其中5、10 μmmol/L组较高糖组明显增高(P < 0.01)。各组G2期细胞比例差异无统计学意义(P > 0.05)。

3 讨 论

白藜芦醇的作用机制复杂,不同浓度、不同作用时间可产生截然不同的影响,处理不同细胞也可产生不同效应。以往研究证实白藜芦醇浓度在50 μmmol/L以上可以抑制多种肿瘤细胞的增殖。本研究结果显示,白藜芦醇能抑制高糖诱导的RMC增殖,且在2.5~10 μmmol/L浓度范围内存在量效依赖关系。国内曾有文献报道0~400 μmmol/L浓度的白藜芦醇对RMC增殖的影响〔6〕,其结果与本文一致。高糖能诱导RMC增殖,而被激活的RM C可产生和释放多种炎症因子和生长因子,并引起细胞外基质合成增多,最终导致肾小球硬化,进而在DN的发生和发展中起重要作用。本研究结果显示,白藜芦醇能抑制高糖诱导的RMC增殖,从而可以延缓DN的发生和发展,对肾脏起到一定的保护作用。

进一步测定RMC的细胞周期分布,结果显示随白藜芦醇浓度增加G1期细胞比例下降,S期比例上升,说明白藜芦醇可抑制RMC从S期进入G2/M期,将其阻滞于S期,从而抑制RMC的生长。对卵巢肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、肝脏星状细胞等的研究也有类似发现〔7, 8, 9〕。对RMC凋亡率的检测结果显示白藜芦醇能诱导高糖作用下RMC的凋亡,但凋亡率并不高,说明诱导凋亡可能在白藜芦醇抑制RMC增殖中起一定作用,但不是主要作用途径。

参考文献
〔1〕 黄建芳, 郭瑞德, 陈钦宏, 等.糖尿病早期肾损伤尿蛋白电泳联合检测[J].中国公共卫生, 2010, 26(5): 599-600.
〔2〕 Mark L, Nikfardjam M S, Avar P, et al.A validated HPLC method for the quantitative analysis of trans-resveratrol and trans piceid in Hungarian wines[J].J Chromatogr Sci, 2005, 43: 445-449.
〔3〕 杨菊红, 王楠, 冯凭.白藜芦醇与糖尿病关系的研究进展[J].国际内分泌代谢杂志, 2009, 29: 36-39.
〔4〕 Tikoo K, Singh K, Kabra D, et al.Change in histone H3 phosphorylation, M A P kinase p38, SIR 2 and p53 expression by resveratrol in preventing streptozotocin induced type I diabetic nephropathy[J].Free Radic Res, 2008, 42: 397-404.
〔5〕 Sharma S, Anjaneyulu M, Kulkarni SK, et al.Resveratrol, a polyphenolic phytoalexin, attenuates diabetic nephropathy in rats[J].Pharmacology, 2006, 76: 69-75.
〔6〕 宋其蔓, 孙洞箫, 孙晋芳, 等.白藜芦醇对大鼠系膜细胞增殖和细胞周期的影响[J].中国中西医结合肾病杂志, 2008, 9: 352-354.
〔7〕 Tyagi A, Singh R P, Agarwal C, et al.Resveratrol causes Cdc2-tyr15 phosphorylation via ATM/ATR-Chk1/2-Cdc25C pathway as a central mechanism for S phase arrest in human ovarian carcinoma Ovcar-3 cells[J].Carcinogenesis, 2005, 26: 1978-1987.
〔8〕 Hsieh TC, Wang Z, Hamby CV, et al.Inhibition of melanoma cell proliferation by resveratrol is correlated with upregulation of quinine reductase 2 and p53[J].Biochem Biophys Res Commun, 2005,334: 223-230.
〔9〕 Souza IC, Martins LA, Coelho BP, et al.Resveratrol inhibits cell growth by inducing cell cycle arrest in activated hepatic stellate cells[J].Mol Cell Biochem, 2008, 315: 1-7.