A 群轮状病毒是引起全球婴幼儿严重腹泻的重要病原之一,< 5岁儿童几乎均感染过轮状病毒,在世界范围内每年约有61 万名儿童因轮状病毒腹泻而死亡^〔1〕。轮状病毒属呼肠病毒科(Reo virida e ),基因组为由11 个片段组成的双链 RNA,分别编码6个结构蛋白( V P1~ VP4,VP6,VP7) 和5个非结构蛋白( NSP1~ N SP5)。外部衣壳由VP4和VP7组成,二者都是中和抗原,可以诱导机体产生中和抗体^〔2〕。根据 VP7和V P4的特异性,可将轮状病毒分为G 型( V P7)和P型 ( V P4) 2个血清型。VP4又以基因序列不同而分型,称P〔4〕 基因型^〔3〕。迄今发现14 种G 血清型和21种P血清型,其中只有10种G 和11种P血清型能感染人类,常见血清型别为 G 1、G 2、G3、G4、P1A 即基因型P〔8〕、P1B 即基因型P〔4〕。 为了探讨儿童腹泻标本A 群轮状病毒分离株的G 血清型和 P基因型流行特点及其变异情况,为临床治疗和疫苗制备提供相关资料,本研究选取浙江省温州医学院附属第二医院 2007年5月- 2010年4月因腹泻症状就诊儿童的送检标本进行检测分析。结果报告如下。

选取2007年5月- 2010年4月温州医学院附属第二医院因腹泻症状就诊儿童粪便标本9 980例,筛检A 群轮状病毒抗原阳性标本,留取其中2009年11月- 2010 年4 月≤5 岁住院腹泻患儿轮状病毒抗原阳性标本168份,于 - 70℃ 冰箱保存。

( 1) 试剂: A组轮状病毒胶体金快速检测试剂盒(北京万泰生物药业有限公司),Tr izo l( 美国In v itrogen公司) ,逆转录试剂盒( 杭州博日科技有限公司) ,TaqDNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司); ( 2) 引物: 参考文献 ^〔4〕 设计引物序列,由上海生物工合成。

取粪便标本1 g,用生理盐水 10倍稀释,3 000 r /m in离心10 m in,取上清500 L,加入Tr izo l裂解后静置5 m in,加入100 L 氯仿,振荡混匀,4 下 12 000 r/m in离心10 m in,将上清吸出,加入到等体积异丙醇中,沉淀10 m in,用75%乙醇洗涤沉淀,4 离心5 m in,弃上清。室温晾干5 ~ 10 m in,用50 L H₂O溶解RNA,- 70℃ 备用。

所有送检标本采用A 组轮状病毒胶体金快速检测试剂盒进行初筛; 轮状病毒抗原阳性、 ≤5 岁住院腹泻患儿标本采用逆转录- 聚合酶链反应( RT PCR) ^〔5〕 进行VP7 基因阳性筛检。 扩增VP7 全长基因,反应条件: 45℃ 30 m in,95℃ 变性3 m in; 94℃ 30s,42 30s,72 ℃ 1 m in,30个循环; 72℃ 延伸5 m in。配制1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,观察有无VP7 扩增产物( 1 062 bpDNA); VP7阳性标本,再采用RT PCR扩增VP4 基因全长,反应条件同上,1. 5% 琼脂糖凝胶电泳观察有无 VP4扩增产物( 877 bpDNA)。

对VP7基因、VP4基因均为阳性的标本,以VP7、VP4基因全长DNA为模板,采用巢式- 聚合酶链反应( N est-PCR )分别进行分型扩增。G血清分型扩增反应条件: 95℃ 变性3 m in; 94℃ 30s,45℃ 30s,72℃ 1 m in,30个循环; 72℃ 延伸5 m in。P基因分型扩增反应条件: 95 ℃ 变性3 m in; 94℃ 30s,50 ℃ 30s,72 ℃ 1 m in,30个循环; 72℃ 延伸5 m in。配制1.5%琼脂糖凝胶进行电泳并观察,根据引物设计长度比对判定扩增条带的长度及型别。

采用SPSS 18.0 软件进行统计分析,计数资料用 χ²检验。

2007年4 月- 2010 年4 月,共送检儿童腹泻便标本9 980份,其中男性6 885人,女性3 095 人; 年龄最大5 岁,最小7 d。检出A 群轮状病毒抗原阳性 3 544份,阳性率为35.51%。( 1) 时间分布( 图 1) : A 群轮状病毒腹泻全年均可散发或流行,其中以秋冬季和春季( 10月- 次年5月)检出率较高,可能与季节交替、天气变化有关,2007 年除10月、11月外,其他月份检出率均高于往年同期。( 2)性别分布: 2009年5月- 2010年4月门诊和住院腹泻患儿腹泻标本共3387份,,其中男孩2319例中,A 群轮状病毒抗原阳性590例,检出率25.44%; 女孩1 068例中,检出279例,检出率26. 12%; 性别检出率差异无统计学意义( χ² = 0.178,P = 0. 673)。( 3)年龄分布: 各月龄儿童轮状病毒抗原阳性检出率分别为0 ~ 5 个月21. 58% ( 200/927),6 ~ 12 个月30. 44% ( 426 /1 465),> 12个月24 . 42% ( 243 /995),以6~ 12个月年龄段检出率最高,差异有统计学意义( χ² = 17 885,P = 0.000)。

图 1

图 1 2007 年5月- 2010 年4 月轮状病毒检出率

图 2

注: M: M arker; 第1、3、4、6、8、9株: G1型( 749 bp) ; 第2株: G1G3型; 第5、7 株: G3 型( 374 bp ); 第10株: 阴性对照。 图 2 10 份标本G 血清型分型产物

图 3

注: M: M ark er; 第1、2、6株: P〔4〕型( 484 bp ); 第3、7株: P〔8〕 P〔4〕型; 第4、5、8 株: P〔8〕型( 346 bp) ; 第9株: 阴性对照。 图 3 9份标本P 基因型分型产物

2009 年11 月- 2010 年4月留取的 ≤ 5 岁,A 群轮状病毒抗原阳性住院腹泻患儿便标本168份中,男童109例,女童59例; 0~ 5个月 31例,6~ 12个月121 例,> 12个月16例。检出VP7和VP4 基因均阳性的标本153份。PCR 分型扩增分别得到大小为 749、374 bp的条带(图 2)及484、346 bp的条带(图 3) 。

表 1

表 1 153份轮状病毒G血清型和P基因型组合结果

表 1 153份轮状病毒G血清型和P基因型组合结果

G3 型79份,占51.63%; G1型40份,占26.14% ; G1G3型20份,占13.07%; G2G3型 3份,占1.96%; G 未分型11份,占7.19% ); P〔8〕型104份,占67.97%; P 4 型3份,占1.96%; P〔8〕P〔4〕型1 份,占 0 65%; P未分型45份,占29 .41%。G 血清型和P基因型分布的组合以G3P〔8〕为主,占33 . 33% ( 51 /153)。

A 群轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原之一,感染高峰季节在不同地区差别较大,秋冬季是高发季节。本研究结果显示,5、10、11月是轮状病毒检出率的高峰月份,温州地处中国东南沿海,亚热带季风气候,可能是发病高峰月份与全国其他地区如上海 ^〔6〕 、北京 ^〔7〕 、苏州 ^〔8〕 等地略有差异的原因。

本研究结果显示,轮状病毒的感染率与性别无关,6~ 12 月龄儿童为主要感染人群。这是因为该年龄组的婴幼儿免疫系统发育尚不健全,来自母体的抗体此阶段也降至最低,Prat ibha ^〔9〕 等研究显示,轮状病毒腹泻患儿体内相应血清型的中和抗体高于母亲体内水平,如果母亲体内中和抗体滴度比较低,则出现该血清型流行时,其子女便易感染。

研究表明,A群轮状病毒流行毒株在不同年份、不同地区存在差异。感染人类的主要型别为G1、G2、G3、G4型。2001 年以来,G3型已取代G1型成为最常见的优势毒株 10- 11 ,本研究分型结果显示,G3 占51 63%,与之符合,P〔8〕型占 67 97%,与文献报道接近,而P〔4〕占1 96%,低于国内文献报道 ^〔8〕 ,另有45份( 29 .41% )未能分型,与重庆地区2010年的分型研究结果一致 ^〔12〕 ,高于一般国内文献报道。G血清型和P基因型组合以G3P〔8〕为主,占67 . 97% ( 104 /153),与国内报道一致。

A群轮状病毒可引起肠外感染,最常见合并呼吸道感染,合并心肌损害、肝脏损害和神经系统的感染也逐渐成为研究的重点,路新国等 ^〔13〕 通过历史队列研究发现轮状病毒感染与轻度胃肠炎并良性婴幼儿惊厥具有相关性,Iturr iza G m ara 等 ^〔14〕 从有神经系统感染症状的轮状病毒腹泻患儿的粪便和脑脊液中分离出轮状病毒病毒,经测序与二者均为G1P8型,有明显相似性,且与社区广泛流行并引起腹泻的G1P8株无明显差异。

随着研究的不断深入和诊断技术的发展,陆续发现一些罕见毒株如G9、G5、G12等,中国台湾南部发现G9 型轮状病毒是2001年4月- 2002年3月儿童感染性腹泻的主要病原之一 ^〔11〕 ,我国河北卢龙县曾分离出1株G5 ^〔15〕 。G9的关注度逐年升高,并且检出率有逐年增多的趋势。说明轮状病毒具有多变复杂的分子流行病学特点及其遗传学上多样易变的特性。本研究有助于更好的了解当地轮状病毒的流行病学特征,为研发有效的疫苗提供更有利的资料。