中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (3): 284-286   PDF    
引用本文
黄波, 龙颖, 罗振华, 黄锐, 贺性鹏. 茶多酚对铀矿尘致支气管上皮细胞损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(3): 284-286.
HUANG Bo, LONG Ying, LUO Zhen-hua, et al. Protective effects of tea polyphenols on oxidative damage induced by uranium-mineral dust in BEAS-2B cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(3): 284-286.
茶多酚对铀矿尘致支气管上皮细胞损伤保护作用
黄波, 龙颖, 罗振华, 黄锐, 贺性鹏     
南华大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室 湖南 衡阳 421001
收稿日期: 2010-08-17.
基金项目: 国家自然科学基金(30670634);湖南省教育厅科研基金(07C619)
作者简介: 黄波(1974- )男,四川荣县人,副教授,博士,研究方向:放射毒理。
通讯作者: 贺性鹏,E-mail:xingphe@tom.com
摘要: 目的 探讨铀矿尘诱发细胞氧化损伤及茶多酚(tea polyphenols,TPs)的保护作用。方法 以人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为靶细胞,分别用辣根过氧化物酶介导的酚红氧化法、细胞色素C还原法和番红花红褪色法测定细胞外液过氧化氢、超氧阴离子和羟自由基含量;细胞内H2O2和O2.-分别用2,7-二氯荧光黄双乙酸盐和氢化乙锭标记,荧光法测定荧光产物2,7'-二氯荧光黄和溴乙锭荧光强度,多核细胞法体外研究细胞次黄嘌呤磷核糖基转移酶基因(HPRT)突变,自动生化仪测量乳酸脱氢酶。结果 BEAS-2B细胞经铀矿尘染毒后,细胞内和细胞外ROS含量明显增高,高剂量组细胞上清中超氧阴离子为(10.48±0.75)μmol/L,茶多酚保护组为(9.31±0.71)μmol/L;细胞乳酸脱氢酶溢出,HPRT突变率升高,高剂量组细胞突变率为1.092‰,茶多酚保护组为0.925‰,TPS对铀矿尘诱发的损伤有明显的抑制作用。结论 铀矿尘可造成细胞的氧化损伤,TPS通过清除活性氧而达到保护作用,可为铀矿尘损伤的防护提供有效措施。
关键词: 铀矿尘     人支气管上皮细胞     活性氧     次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶     茶多酚    
Protective effects of tea polyphenols on oxidative damage induced by uranium-mineral dust in BEAS-2B cells
HUANG Bo, LONG Ying, LUO Zhen-hua, et al    
Department of Occupation and Environment Health, School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China
Abstract: Objective To observe oxidative damage of human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) induced by uranium-mineral dust(UD) and protective effect of tea polyphenols(TPs).Methods The measurement of extracellular superoxide anions(O2·-) was based on the reduction of ferricy to chrome C.The quantitation of extracellular hydrogen peroxides(H2O2) was based on horseradish peroxidase-dependent oxidation of phenol red.The determination of extracellular hydroxyl radicals(·OH) was based on the decoloration of safranine T.E thidium bromide, 2, 7'-dichlorofluorescein, and fluorescent products of membrane-permeable dyes-hydroethine and 2, 7'-dichloroflurescein diacetate were used to monitor in tracellular production of O2· and H2O2, respectively.The conten to flactate dehydrogenase was measured by AUTOLAB.Cytokinesis-block(CB) assay was used to detect the mutation frequency of hyloxan thine-guanice phosphoribosyl tranferase (HPPT).Results The reactive oxygen species (ROS) production including H2O2, O2·-, and ·OH induced by UD increased remarkably in BEAS-2B cells.Superoxide anion was 10.48±0.75μmol/L in high dose group and 9.31±0.71 in TPs group.The mutation frequency (MF) of HPRT gene increased.MF of HPRT gene was 1.092‰ in high dose group and 0.925‰ in TPs group.The changes could be inhibited effectively by 250mg/L of TPs.Conclusion UD causes oxidative damage in BEAS-2B cells.Through removing active oxygen, TPs can inhibit oxidative damage of UD.It can provide an effective measure to the protection of UD.
Key words: uranium-mineral dust     BEAS-2B     reactive oxygen     HPRT     tea polyphenols    

铀矿尘是铀矿勘探开采的主要职业性有害因素,铀矿尘的组成除了非放射性的二氧化硅粉尘外还包括放射性粉尘和凝聚核,铀矿粉尘可通过呼吸道进入人体形成内辐射,从而发生辐射效应造成铀矿工肺癌高发的情况〔1, 2〕,但其致癌机制尚未明了。由于铀矿尘的接触人群多,影响长远,因此铀矿尘的毒性机制研究及相关医学防护制剂的研制是亟待解决的问题。本研究拟通过铀矿尘对细胞的损伤作用进行研究,并以茶多酚为保护剂,为铀矿尘致人体损伤防治提供依据。

1 材料与方法 1.1 细胞分组及染毒

人支气管上皮细胞系( BEAS-2B),铀矿尘(南华大学核工业铀矿溶浸采矿重点实验室) 用玛瑙研钵研磨后,经500目筛过筛,高温高压消毒后用无血清培养液 ( LHC-8)配成5 m g /mL 混悬液,将指数生长期的BEAS-2B 细胞,按1 × 105 个细胞/孔接种在24孔培养板内,达到80%融合后,将细胞分为空白对照组、铀矿尘染毒组( BEAS-2B)和茶多酚保护组( BEAS-2B + TPS )。铀矿尘染毒组按铀矿尘终浓度1. 0,1.5,2.0 mg /mL加入细胞中; 茶多酚保护组在铀矿尘染毒前2h加入终浓度为250 m g /L的茶多酚(无锡太阳绿宝科技有限公司) ,每个剂量12个平行样。

1.2 细胞外O2· - 、H2O2、· OH 测定

在铀矿尘染毒的同时,加入活性氧的捕获剂。染毒2 h后用尤里柯UV2102紫外可见分光光度计测定细胞上清自由基。其中O2· - 用终浓度为 50 μm o l/ L 的细胞色素C (美国S igm a 公司) 捕获,测定550 nm 吸收值进行定量; H2O2 用终浓度20 U /mL 的辣根过氧化物酶(美国S igma 公司) 和10 μg /mL酚红捕获,测定620nm 吸收值,并用H2O2 标准曲线进行定量。OH 用16 m g /mL 的蕃花红T( 北京东环联合化工厂)捕获,测定52 0nm 吸收值进行定量〔3, 4〕。

1.3 细胞内H2O2 和O2· - 测定

指数生长的BEAS- 2B 细胞分别用终浓度20μm o l/ L 2,7. - 二氯荧光黄双乙酸盐 ( DCFH - DA,m olecu lar probes)和终浓度10μmo l/L 氢化乙锭 ( HE,m o lecular probes )标记,37 ℃ 孵育5 m in后进行染毒,继续孵育2 h后,冰浴冷却,立即用荧光化学发光仪( Therm o Lab F luoroskan A scen t FL,美国Therm o 公司) 分析测定。细胞内还原型2,7’- 二氯荧光黄被H2O2 氧化成氧化型2,7- 二氯荧光黄( DCF),HE 被转化为溴乙锭( EB ),DCF和EB能分别产生绿色和红色荧光,测定细胞内DCF和EB的荧光强度,即可相对定量细胞内H2O2 和O2· - 水平〔5〕。

1.4 乳酸脱氢酶的测定

染毒方法同上,终止反应后收集细胞上清,2 000 r/m in、4 ℃ 、离心10 m ins,取上清。利用乳酸脱氢酶试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司),在AUTOLAB 全自动生化仪采用动式测量法测量。

1.5 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因突变( hypoxanthineguan ine pho sphoribosy l transferase,H PRT) 检测

指数生长的 BEAS- 2B 细胞,分为2 组: 铀矿尘染毒组、TPS 保护组,铀矿染毒组加入终浓度分别为0,.0,1.5,2.0 mg /mL铀矿尘,TPS 保护组加入终浓度分别为0,1.0,1.5,2.0 mg /mL铀矿尘且在铀矿尘染毒之前2 h加入250 mg /L的茶多酚进行保护。2组细胞在铀矿尘染毒24 h后,洗去铀矿尘,换新的培养液培养。 培养至第5代时,将2组8种细胞按文献〔6〕的方法检测HPRT 突变率,所得结果为HPRT基因位点突变频率( ‰ )。

1.6 统计分析

采用SPSS 10.0 软件进行统计学分析,O2· - 、H2O2 、OH、LDH 含量采用成组t检验,H PRT 基因突变采用χ2检验,以P < 20.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 茶多酚对铀矿尘致细胞外O2· - 、H2O2、· OH 含量影响 ( 表 1)
表 1 BEAS- 2B细胞上清中ROS产生情况(x± s , n= 12)

铀矿尘在0.5~ 2.0 m g /mL范围内,可以诱发BEAS - 2B细胞上清中H2O2 和· OH 及O2· - 自由基含量增高,与对照组比较差异有统计学意义(P < 20.05)。TPS保护组对铀矿尘诱发BEAS - 2B细胞上清中ROS 水平的增高有明显抑制作用。

2.2茶多酚对铀矿尘致细胞内O2· - 、H2O2 含量影响(表 2)
表 2 BEAS- 2B细胞内产生的ROS产生情况(x± s , n= 12)

铀矿尘在1.0~ 2. 0 m g /mL 范围内,BEAS - 2B 细胞内H2O2 和O2· - 自由基含量随铀矿尘浓度的增高明显增高。 250 mg /L的TPS对铀矿尘诱发细胞内ROS 水平的增高有明显抑制作用。

2.3 茶多酚对铀矿尘致细胞膜损伤作用及H PRT突变作用影响(表 3)
表 3 BEA S- 2B细胞LDH变化情况及HPRT突变频率(x± s , n= 12)

BEAS- 2B 细胞经不同剂量的铀矿尘染毒后,细胞上清中LDH 测定结果表明,铀矿尘对细胞膜有较大的损伤作用,细胞上清中的LDH 随铀矿尘浓度的增高明显增高。 茶多酚对铀矿尘诱发BEAS- 2B 细胞外LDH 增高有明显抑制作用,能减轻对细胞膜的损伤作用。铀矿尘作用24 h后,随着染毒浓度的增加,H PRT基因突变率显著增加,与对照组比较差异有统计学意义(P < 20. 05),而250m g /L TPS保护组能有效地抑制HPRT 基因突变率增加,与同剂量的铀矿尘染毒组比较差异有统计学意义(P < 20.05) 。说明TPS 对铀矿尘所诱发的遗传毒性具有较好的保护作用。

3 讨论

本研究结果表明,铀矿尘作用BEAS- 2B细胞后,细胞内外的活性氧均增高,细胞膜破裂,引起基因突变,造成遗传毒性。同Per iyakaruppan〔7〕发现大鼠肺上皮细胞经UO22 + 处理后,细胞的抗氧化物质减少,氧化应激反应加重结果相似,自由基作用于DNA 碱基,诱发基因突变。作用于DNA 主链时,可致DNA链切断,引起染色体缺损转位。自由基通过改变细胞膜通透性或导致离子通道受体、磷酸化反应等细胞内可逆性变化。对DNA 的不可逆性变化和对细胞应答的可逆性变化,将细胞推向癌变。乳酸脱氢酶是存在于细胞内的常见的代谢酶,是测定细胞膜完整性的重要指标。若外来化合物造成细胞膜的直接损害,细胞内酶就从细胞内释放到培养液中。 茶多酚是从绿茶中提取的多酚类化合物,具有较强的清除自由基抗氧化性能,生物性能广泛〔8〕。加入茶多酚后对铀矿尘诱发BEAS- 2B 细胞内外活性氧的增高有明显抑制作用,乳酸脱氢酶的外溢也大大减少,从而有效地抑制了遗传毒性,为铀矿尘的损伤防护提供了依据。

参考文献
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〔7〕 Periyakaruppan A, Kumar F, Sarkar S, et al.Uranium induces oxidative stress in lung epithelial cells[J].Arch Toxicol, 2007, 81(6):389-395.
〔8〕 陈慧中, 徐兆发, 裴秀丛.茶多酚、维生素C对镉肾毒性影响的实验研究[J].中国公共卫生, 2003, 19(11): 1338-1340.