2011, Vol. 27
2. 广西壮族自治区人民医院;
3. 广西疾病预防控制中心;
4. 柳州疾病预防控制中心;
5. 中国疾病预防控制中心
目前,人类免疫缺陷病毒( H IV-1) 载量常用的检测技术及试剂盒主要为欧美发达国家所掌握,由于成本原因这些试剂盒难以在发展中国家广泛使用〔1〕。随着中国艾滋病感染者的增多,建立经济的、适合国情H IV-1主要毒株的病毒载量检测方法非常必要。实时荧光定量PCR( RT-PCR) 是一种具备成本优势和不同地区不同亚型适应性的技术,在发展中国家具有广泛的应用前景 〔2, 3, 4〕。本研究就建立H IV- 1 毒株的 RT PCR 检测方法进行探讨,现将结果报告如下。
1 材料与方法 1. 1 材料2006年2月至2007年3 月采集来自广西56例经免疫印迹法确诊的H IV- 1阳性感染者和52例H IV- 1阴性病例,血样采集后6 h内分离血浆,- 80℃ 冰箱保存备用。
1. 2 探针引物设计从Los A lamos H IV database( http: / /h iv w eb. lan.l gov) 下载国内H IV- 1 主要流行毒株的基因序列,由日本Takara 公司合成,引物探针序列如下: 上游引物5 GGCAGCAATGCAAATGTTAAA 3 ; 下游引物5 TCATCTGGC CTGGTGGAATA 3 ; 探针5 ( FAM ) CCATCAATGAGGAAGCT GCAGAATGGGA( Ec lipse) 3 。
1. 3 外标准品制备扩增H IV- 1感染者GAG 区基因片段,扩增产物连入pMD18 T 载体构建重组质粒,经测定浓度后稀释成1. 5 × 108 ~ 1. 5× 102 cop ies /mL浓度,用作RT PCR 的外标准品。
1. 4 RT-PCR反应逆转录采用Rever tA id First S trand cDNA Syn thesis K it试剂盒(加拿大Fe rm entas公司),PCR扩增采用 Prem ix Ex TaqTM ( Perfec t Rea l Tim e ) 试剂盒( 日本Takara 公司) 进行反应,按试剂盒说明书操作。反应条件为: 95 ℃ 3 m in 预变性; 95℃ 20 s变性,57. 5℃ 20 s退火,72℃ 30 s延伸; 扩增40个循环,在72℃ 延伸时收集荧光信号。扩增过程在7500 Fast实时荧光定量扩增仪(美国ABI公司)上完成。
1. 5 灵敏度、特异度、重复性试验以梯度稀释的重组质粒为模板验证方法定量范围和检测下限。以52例阴性病例,1 份重组质粒,2份H IV- 1阳性病例进行双盲检测,评价方法的特异性。对同一标本进行连续6次PCR 反应,每次做6 个平行管,计算批间和批内变异系数。
1. 6 病毒载量仪检测采用B iom er ieux NucliSens EasyQ® H IV- 1 v1. 1病毒监测仪(法国梅里埃公司)对56份H IV- 1阳性样本和52份H IV- 1阴性病例检测,检测严格按照仪器和试剂盒说明书操作。
1. 7 统计分析采用SPSS 13. 0软件分析,批间和批内差异的比较采用区组设计的方差分析检验,2 种方法一致性评价采用配对样本t检验,2种方法相关性评价采用Pearson 相关分析,检验水准 α= 0 05。
2 结果 2.1 检测范围和检测下限RT PCR 方法最低检测下限为150 copies /mL,最佳线性范围为1. 5 × 102 ~ 1. 5× 10.8 copies/mL,回归直线为y= - 3 384x + 46 .589,R2 = 0 .996 8。
2 .2 特异度试验RT-PCR 方法对1 份重组质粒和2 份 H IV- 1阳性对照给出病毒载量结果,而52例H IV- 1阴性病人未形成扩增曲线,结果为阴性,表明该方法特异性良好。
2.3 重复性试验第1、2、3、4、5、6次试验的批内变异系数分别为2 02%、2 17%、1 42%、2 72%、2 28% 和2 81%,批间变异系数为3 99%。6次试验结果经方差分析检验,批内和批间差异均无统计学意义(P > 0. 05)。
2 .4 一致性评价依赖核酸序列的扩增技术( NASBA) 法测得56份H IV- 1阳性感染者的病毒载量的平均值为2.95×104 copies/mL,实时荧光定量PCR 法为2. 57× 104 copies/mL,2 者无统计学差异( t= 1 . 207,P > 0. 05)。
2. 5 相关性评价NASBA 方法的H IV 病毒载量检出率为 94. 6% ( 53 /56),RT PCR方法为89.3% ( 50 /56),检出率差异无统计学意义( χ2 = 1 087, P > 0. 05); 2方法所检出病毒载量经相关和回归分析显示,2 方法的回归方程为: y = 0. 671 + 0.861x,r= 0 .880 ( P < 0. 01),即2 方法病毒载量线性关系良好。
3 讨论国内外研究表明,RT PCR 方法具备地区和亚型适宜性,简便快捷,检测效能达到甚至优于商业化试剂盒。本研究针对中国H IV- 1流行毒株建立的RT PCR方法,检测范围宽,灵敏度高,实际检出范围1. 5× 102 ~ 1 .5 ×108 cop ies /mL; 特异性及重复性好,方法的批内和批间变异系数均 < 4%。经与标准病毒载量检测方法比较,2种方法的H IV- 1病毒载量结果非常接近,2组均数相差0 .38× 104 cop ies /mL,在参考容许误差范围内 〔5〕,配对t检验结果表明,差异无统计学意义( P > 0 .05),说明2种方法具有较好的一致性,与Rekhv iashv ili N 研究结果一致 〔6〕。相关和回归分析则表明2方法存在良好相关性( r= 0.880 ),提示可用RT-PCR 检测结果近似的预测 NASBA 检测结果,反之亦然。另外,本研究建立的RT PCR 方法的检测费用约为100元/人次,与Rouet 〔4〕报道的12 美元/人次相近,与中国罗予等人 〔7〕建立的荧光定量方法价格基本相同,而与商业化试剂盒( 800~ 1 200元/人次) 比较则具有明显价格优势。
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