肿瘤细胞与细胞外基质、基膜的相互作用是浸润转移的关键步骤,由肿瘤细胞和周围间质合成和分泌的基质金属蛋白酶,能够降解细胞外基质和基膜的主要成分,导致肿瘤的组织结构发生变化,以利于其进一步侵袭和转移扩散。IV 型胶原( co llagen IV )是细胞外基质的主要成分,构成基膜并调控细胞粘附,与恶性肿瘤的浸润扩散有关。基质金属蛋白酶- 2 (MM P-2)和基质金属蛋白酶- 9(MM P-9) 可以通过特异性降解IV 型胶原和细胞外基质并影响组织重塑促进肿瘤细胞的浸润、转移和血管形成^〔1〕。本研究于2010年1月15日- 5 月25日对河南科技大学第一附属医院病理科诊断的60例乳腺癌标本进行免疫组化双染检测,分析MM P-2、MM P-9和IV 型胶原在乳腺导管癌的表达及相互关系。

选取河南科技大学第一附属医院病理科2008年 2月1日- 2010 年4月25日期间的乳腺癌蜡块60 例,其中导管内癌18例,微浸润性导管癌12例,浸润性导管癌30例。 所有患者均为女性,年龄30~ 81岁,中位年龄48岁。肿瘤直径 2 cm 29例,> 2 cm 31例。腋下有淋巴结转移23 例,无淋巴结转移37例。人类表皮生长因子受体- 2( C-erbB-2) 阳性47例,阴性13例。所有病例术前均未进行放疗、化疗、内分泌治疗等。另选10例正常乳腺组织作为对照组。

浓缩型鼠抗人MM P-2单克隆抗体、即用型鼠抗人 MM P-9单克隆抗体、即用型鼠抗人co llagen IV 单克隆抗体、 DouSP免疫组化双染试剂盒(福州迈新生物工程有限公司)。

为了控制MM P-2、MM P-9 和IV型胶原双染结果的可靠性,采用福州迈新公司提供的双染阳性片进行对照,用磷酸盐缓冲液( PBS) 代替一抗作阴性对照。4μ m 切片脱蜡、水化,蒸馏水浸泡10 m in,胃酶修复及内源性过氧化酶阻断,血清封闭,滴加MM P-2 (工作浓度1: 30)、MM P-9 4℃过夜16 h,生物素标记的二抗10 m in,链霉菌抗生物素- 碱性磷酸酶溶液10 m in,碱性磷酸酶显色系统( BCIP /NBT) 显色。滴加双染增强液20 m in,血清封闭,滴加Co llag en IV 室温下2 h,生物素标记的二抗10 m in,链霉菌抗生物素- 过氧化酶溶液10 m in,3- 氨基- 9 - 乙基卡唑( AEC) 显色。苏木素复染,水性封片剂封片。

MM P-2和MM P-9定位于胞浆,光学显微镜下细胞质中出现蓝黑色颗粒或者弥漫性棕褐色染色( BCIP / NBT /碱性磷酸酶显色系统) 为阳性。参照Bartsch的判断标准^〔2〕,计数100个细胞呈现的阳性细胞数,结合显色强弱分别为: 阴性( - )不显色; 弱阳性( + ) 25%; 中度阳性( + + ) 26% ~ 50%; 强阳性( + + + ) > 50%。3- 氨基- 9- 乙基卡唑/过氧化酶显色系统( Co l IV ) 也定位于胞浆,阳性反应为胞浆出现弥漫红色( AEC /过氧化酶显色系统),用于标记基膜。IV 型胶原阳性: 肿瘤细胞与基质间有连续的红色染色带或者肿瘤细胞基膜染色带偶有断裂,但主要形式是连续的; IV 型胶原阴性: 大部分肿瘤细胞周边红色基膜染色带缺乏或者呈不连续的碎片状。

采用SPSS 17.0 软件进行χ² 检验及列联表 Spearm an等级相关进行分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 MMP-2、MMP-9和Co llagen IV在正常乳腺 组织和乳腺导管癌中的表达

表 1 MMP-2、MMP-9和Co llagen IV在正常乳腺 组织和乳腺导管癌中的表达

MM P-2、MM P-9在乳腺癌中的表达阳性率明显高于乳腺正常组织; IV型胶原在乳腺正常组织的表达高于乳腺癌组织。 三者在正常组织和癌组织的表达差异均有统计学意义( P < 0 .05)。MM P-2和MM P-9 在乳腺导管内癌和微浸润性导管癌中的表达有明显靠边化趋势,在同一个导管中,导管中央部分表达强度低于导管外周接近基膜处的表达强度,甚至有的导管内癌仅在接近基膜处有MM P-2 、MM P-9 的阳性表达。 在微浸润导管癌中,MM P-2、MM P-9在刚突破或者将要突破基膜处表达增强,呈弥漫的巢状或者团状。另外,部分临近癌细胞的间质细胞也有MM P-2、MM P-9的少量表达。

表 2

表 2 MMP-2、MMP-9的表达与临床病理参数间的关系

表 2 MMP-2、MMP-9的表达与临床病理参数间的关系

MM P-2、MM P-9 在不同年龄组、雌激素受体、孕激素受体、上皮钙粘蛋白分组间的表达差异均无统计学意义( P > 0 .05); 而在肿瘤直径> 2 cm、有淋巴结转移及CerbB2 阳性的乳腺导管癌组织中的表达明显高于相应对照(P< 0. 05)。

表 3

表 3 MMP-2、MMP-9与Co llagen IV的相关性分析

表 3 MMP-2、MMP-9与Co llagen IV的相关性分析

Co l IV 的表达与MM P-2表达呈负相关( r= - 0 .506,P < 0.05),与MM P-9 的表达亦呈负相关( r = - 0. 501,P < 0.05),即随着MM P-2、MM P-9表达的增加,Co l IV 的表达降低。

本研究结果表明,MM P-2、MM P-9 在肿瘤直径> 2 cm 和有淋巴结转移的乳腺导管癌组织中的表达高于肿瘤直径 2 cm 和无淋巴结转移的乳腺导管癌组织,与Shah、L i等3- 4研究报道结果一致。在乳腺癌细胞转染CerbB2基因能增加细胞的侵袭和转移能力,同时伴有基膜降解酶分泌的增加,包括MM P-2、MM P-9、粘附分子和整合素α2β 3。本研究也证实了CerbB2的表达和MM P-2、MM P-9表达的关系,从另一方面解释了CerbB2 阳性的乳腺癌高侵袭、高转移的作用机制,提示测定乳腺癌患者MM P-2、MM P-9 和CerbB2 的表达水平能更好地反映乳腺癌组织的侵袭转移能力。

本研究结果还表明,MM P-2、MM P-9 在乳腺导管内癌和微浸润导管癌中的表达,有明显的靠边缘化趋势,在同一个导管中在中央部分的表达强度低于导管周边靠近基膜处的表达强度,或者仅在导管接近基膜处和将要突破基膜处有表达,说明这些靠近基膜边缘的肿瘤细胞可能分泌较多的MM P-2、 MM P-9等物质破坏和溶解基膜,具有侵袭和转移潜能,检测它们的含量可作为预后的指标。MM P-2、MM P-9在癌旁的间质细胞也有表达,说明这些癌旁的间质细胞也具备分泌某些基质金属蛋白酶的能力,可能也是潜在的促进癌细胞浸润和转移的生化基础。IV型胶原的表达和MM P-2、MM P-9在乳腺癌的表达呈负相关,说明在肿瘤浸润转移的过程中,伴随着 MM P-2、MM P-9的增加,IV 型胶原在不断的降解。以IV型胶原为骨架的基膜的完整度是反映肿瘤早期浸润的一个指标^〔5〕,联合检测MM P-2、MM P-9和IV型胶原的表达可能有助于分析乳腺癌浸润转移倾向,为判断预后提供可能依据。

本研究认为在乳腺导管癌的局部侵袭和远处转移中,MM P-2、MM P-9 对IV 型胶原的降解可能起重要作用。研究 MM P-2、MM P-9和IV 型胶原的关系有助于探索乳腺癌的浸润转移机制,为乳腺癌的预后评估及找到新的治疗靶点提供依据。