2011, Vol. 27
2. 湖北省五峰土家族自治县妇幼保健院;
3. 上海凌桥卫生院;
4. 深圳创强医疗器械公司;
5. 武汉大学人民医院;
6. 武汉大学公共卫生学院
湖北省五峰土家族自治县位于湖北省西南部,是中国宫颈癌高发区之一,高发原因至今尚不明确。流行病学和分子生物学研究表明,大约95% 的宫颈癌发生与人乳头瘤病毒 ( hum an papillom av irus,HPV ) 感染有关,HPV 感染已被证明是引起宫颈癌及癌前病变的必要因素〔1, 2〕。为了探讨上述地区宫颈癌高发原因,为宫颈癌筛查和疫苗研制等提供基础资料,本研究选择该县部分乡镇妇女宫颈癌现患率、高危型 HPV 感染率、感染型别及H PV DNA 病毒载量以及H PV 感染相关危险因素。现将结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象2008年3月-4月,采用随机抽样方法,选取湖北省五峰县5个镇和3个乡的20~ 65岁智力正常已婚女性 1 032人,在五峰县妇幼保健院协助下进行宫颈癌筛查,所有被筛查者均自愿签署知情同意书。
1.2 方法 1.2.1 问卷调查与标本采集( 1)问卷调查: 采用自制问卷调查表进行调查,内容主要包括姓名、年龄、居住地、健康状况、家族史等一般情况; 与宫颈癌相关的性行为和生育史、避孕措施等高危因素暴露状况; 家庭收入、饮食结构、受教育程度等经济文化因素。由经过统一培训的调查员进行入户调查。( 2)标本采集: 采用棉拭子获取宫颈脱落细胞样本1 032 份,所有样本置于小离心管中-20℃保存。
1.2.2 仪器与试剂科诺KN 2200 型阴道镜( 江苏科诺医学仪器设备有限公司),雷奥LEO 2100 型阴道镜( 徐州雷奥医疗设备有限公司),M iniprep 60实时荧光定量PCR 仪(瑞士 Tecan公司); 病毒DNA提取液(中山大学达安基因股份有限公司),实时荧光定量PCR分型检测试剂盒( 意大利AB 安娜年检试剂,深圳创强医疗器械有限公司) 。
1.2.3 宫颈上皮病变观察采用阴道镜按常规方法观察宫颈上皮病变。宫颈脱落细胞按常规醋酸染色、碘染色后,根据醋白上皮( ace towh ite ep ithe lium ) 厚度、范围、表面形态、浑浊度等判断宫颈上皮细胞是否正常,是否有宫颈上皮内瘤变 ( C IN)或宫颈癌等,判定标准参照文献 〔3〕 : 其中酸染未观察到白色病变,碘染成棕褐色或褐色为宫颈上皮病变阴性; 出现白色改变,碘不着色为宫颈上皮病变阳性; 根据病变程度判断 CIN I、II、III病变或宫颈癌 〔3〕 。
1.2.4 HPV 型别鉴定和病毒DNA载量采用实时荧光定量 PCR技术进行H PV 8种高危型别鉴定,包括16型、18 /45型、 33 /52/58 /67型、31 型,并进行病毒DNA 载量检测。采用 HPV 特异性分型引物和内标引物,扩增内源基因球蛋白基因和待测样品HPV DNA 〔4〕。取宫颈脱落细胞标本,加入1 mL 生理盐水,于振荡器上轻微振荡,离心保留沉淀,加入50 mL 病毒DNA 提取液混匀,100 水浴/干浴10 m in,13 000 r/m in 离心10 m in,取上清直接进行实时荧光定量PCR,具体操作按试剂盒说明书进行。根据结果建立实时荧光定量PCR循环阈值( C t)标准曲线,通过C t值和标准曲线对标本模板进行分型和定量分析。判定标准: PCR 扩增荧光信号超过荧光阈值 ( thresho ld)为型别鉴定阳性。HPV 载量( 绝对定量) = 相对定量值 106 /内标定量值( 其中: 绝对定量是标本中所检基因最初拷贝数或浓度; 相对定量为2组基因或蛋白水平的比值,根据Ct值和已知拷贝数标准品生成的标准曲线获得) 。H PV 载量(绝对定量)用平均拷贝数表示。
1.3 统计分析应用SPSS 13.0软件进行统计分析,分析比较采用χ 2 检验和t检验。
2 结果 2 .1 HPV感染率(图 1) | 图 1 五峰县成年女性不同年龄HPV 感染率比较 |
1 032名女性中,经病理学确诊宫颈癌患者4例,发病率为3.88‰ ,其中,HPV 感染阳性3例,阴性1例。宫颈标本1 032例中,检出HPV阳性123例,阳性率为11 92%; 其中土家族女性宫颈标本896份,检出HPV阳性109例,阳性率为12.17%,汉族女性宫颈标本110份,检出 HPV 阳性9例,阳性率为8.18%,其他民族女性26份,检出 HPV 阳性5例,阳性率为19. 23%。土家族女性与汉族女性比较,H PV感染率差异无统计学意义( P = 0 22)。20~ 25岁和51~ 55 岁年龄组感染率较高,分别为16.67% ( 3 /18) 和 14.46% ( 12/83),> 55岁感染率最低为8.62% ( 5 /58)。
2.2 感染型别分布123 例HPV 阳性标本中,HPV 单型别感染112例,占91.06%,合并感染11例,占8.94%。合并感染中,涉及感染型别23例次,其中16型+ 18 /45型+ 31型合并感染1例,16型+ 33 /52 /58 /67型合并感染6例,18 /45 型 + 33 /52 /58 /67型合并感染2例,33 /52 /58 /67型+ 31型合并感染2例。123例HPV 阳性中,16型占25 18% ( 34 /135),其中单型感染27 例次,合并感染7 例次; 18 /45 型占8 15% ( 11 /135),其中单型感染8例次,合并感染3例次; 33 /52 /58 / 67型占60 00% ( 81 /135),其中单型感染71例次,合并感染 10例次; 31型占6 67% ( 9 /135),其中单型感染6例次,合并感染3例次。型特异性引物分型检测结果显示,H PV 33 /52 / 58 /67型感染中,58型26例,占21.14% ( 26 /123 ),33 型11 例,占8. 94% ( 11 /123),52型27例,占21.95% ( 27 /123),67 型5例,占4.07% ( 5 /123) ; 同时58,33 型合并感染1 例,58,52型合并感染1例。
2.3 各型别病毒DNA载量( 图 2) | 图 2 HPV感染阳性病毒DNA 载量绝对定量值分布图 |
H PV 16型平均拷贝数为1.3×107 ( 5 .8 ×103 ~ 2.01×108 ); 18 /45型平均拷贝数为 4.91×105 ( 6.65×10~ 2.25× 106 ); 33 /52 /58 /67型平均拷贝数位6.80 ×106 ( 2.46×10~ 3.07×108 ); 31型平均拷贝数为 6.21×105 ( 7.32×10~ 5.39 ×106 ); 各型别HPVDNA 病毒载量分布均趋于正态分布,H PV 平均绝对定量值( 拷贝数) 为 2 .93× 105。3例HPV感染阳性的宫颈癌患者HPVDNA载量为,H PV 16 型2例,拷贝数分别为1.45×104,3.35×105; H PV 58型1例,拷贝数为7.10×105; 均趋近于各型平均值,并未见其病毒载量明显高于其他HPV阳性妇女。
2.4 HPV感染与相关因素比较(表 1) | 表 1 HPV 阳性与HPV阴性妇女的婚育性生活比较 |
选取资料完整的110 例HPV阳性和786例HPV阴性妇女及配偶进行分析,结果经t检验,H PV阳性与H PV阴性妇女的婚育及性生活的差异均无统计学意义(P > 0.05)。HPV 阴性妇女及其配偶的整体受教育程度比H PV阳性妇女高,其中大专及以上学历差异有统计学意义(P < 0 .05)。
3 讨论本研究结果显示,五峰县20~ 65岁已婚妇女宫颈癌发病率为3.88‰ ( 388 /10万) ,高危型HPV的感染率为11.92% 。 Cuz ick等研究报道,在印度宫颈癌高发区,高危型HPV感染率为7% ~ 13% 〔5〕 ; Zhang 等对上海(宫颈癌低发地区) 6千余名健康体检妇女进行HPV 检测,结果显示,HPV 的感染率为 29 .1% 〔6〕。Garland等报道 〔7〕 ,澳大利亚( 宫颈癌低发地区) 14岁~ 72岁妇女高危型H PV 感染率为23. 6%。由此可见,五峰县虽属于宫颈癌高发区,但并未显示具有较高的HPV 感染率。提示尽管HPV感染是发生宫颈癌的必要因素,但在宫颈癌高发区,HPV 感染率并不高。今后研究中应着重考虑 HPV 持续感染以及宫颈癌相关的其他高危因素( 遗传易感等)的联合作用。
本研究中检出的4 例宫颈癌患者均为土家族妇女,土家族妇女的H PV 感染率为12. 17%,汉族妇女为8. 18%,土家族妇女感染率略高于汉族妇女,但差异并无统计学意义。高危型HPV感染形成2个年龄高峰段,即20~ 25岁和51~ 55 岁。已婚女性在18~ 28 岁阶段,性生活频繁,HPV 感染机会多,因此易成为生殖道感染的高峰年龄段,但感染大部分是一过性的。我国普查资料表明,< 30 岁已婚妇女宫颈癌较少见,30岁以后,随年龄增加,宫颈癌发病率明显升高,50 ~ 60 岁是高发年龄组 〔8〕 ,因此,对51~ 55岁的HPV 感染高峰应予以关注。
本研究结果显示,HPV 阳性与HPV 阴性妇女在性交年龄,初婚年龄、初产年龄,孕次,产次及性伴侣数等因素构成上与HPV感染无明显相关性,但受教育程度上差异具有统计学意义,即H PV阴性妇女的整体受教育程度较H PV 阳性妇女高。研究显示,宫颈癌的发生与教育程度低有关 〔9〕 ,文化程度越低,宫颈癌发病率相对较高,导致这种结果的原因可能是,文化程度较低的妇女及配偶,对个人生理卫生知识缺乏,第1次性生活及初婚年龄早,因此更易感染HPV 病毒,从而增加患宫颈癌的危险。
研究显示 〔10〕 ,在亚洲地区H PV52和58型感染率显著高于HPV31、33、45型。本研究检测8种高危型别HPV病毒感染,感染率从高到底依次为16型、52型、58 型、33 型,18 /45 型、31型、67型。其中52和58型HPV 感染率仅次于16型。 提示今后对本地区的H PV感染型别研究中,应重视52、58型别的感染率。
DunM ark 等 〔11〕 研究表明,在细胞学正常的妇女中,H PV16载量增加使发展为宫颈上皮内瘤( CIN) 的危险性增加。本研究结果显示,各型别H PVDNA 病毒载量分布趋于正态分布,平均绝对定量值为2.93×105 拷贝,宫颈癌患者病毒载量趋近于平均值,未见高于其他HPV 阳性妇女。因此,H PVDNA病毒载量是否随病情加重而增加,二者是否相关,病毒载量是否与病情轻重有关等,尚需进一步证明。
志谢 本项目得到湖北省卫生厅严本武、张险峰处长的大力支持; 五峰县妇幼保健院黄院长及全体人员的鼎力配合; 美国Georgetown Un i vers ity刘学锋博士协助完成HPV52 /58 /33 /67 型的分型,在此一并致以衷心的感谢
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